RNAi技术的研究进展和发展前景

qiusuo

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是1998年由Fire等在线虫中发现的一种转录后的基因沉默 (Posttranscriptional gene silencing，PTGS)机制。双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)能特异地抑制或沉默目的基因表达，产生如同目的基因突变的缺陷表型，这种由dsRNA介导的基因阻抑作用被称为RNAi。1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组，在矮牵牛中发现的一种转基因能同时抑制相应的内源基因以及自身表达的基因沉默现象，当时将这种现象称为共抑制。到1994 年，由Cogni等在真菌中发现转录后的基因沉默现象，在野生型粗糙链胞霉中转入胡萝卜素基因 albino 1或albino 3时，发现在部分实验中，内源性al 1或al 3基因的表达水平反而减弱，称此现象为基因压制(quelling)。1998年，Fire等在线虫中发现了RNAi现象，并揭示了SuGuo发现正义 RNA对基因表达也有抑制作用的原因，认为SuGuo发现的这种现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量的双链RNA，而且dsRNA能比反义RNA或正义RNA更有效地抑制基因的表达，把由 RNA引起的基因表达的抑制称为RNA干涉。

　　最初普遍认为共抑制、基因压制以及RNAi是机制完全不同的基因抑制现象。但经过科研人员的不断研究，发现在共抑制、真菌中的基因压制以及RNAi现象之间存在着密切的联系。都是由 RNA引起的转录后的基因沉默，可能有共同的生物学意义和相似的作用机制。但是共抑制与 RNAi并不是完全相同，在植物的共抑制中，dsRNA不仅能引起转录后的基因沉默，而且还能引起转录水平的沉默，其可能机制是dsRNA能引起染色质的重组或甲基化而改变其内源基因的序列。因此，在植物共抑制中还存在RNAi以外的由RNA指导的DNA甲基化，而引起转录水平抑制的机制。dsRNA能特异地抑制目的基因的表达，其广泛存在各种有机体中，包括线虫、果蝇、涡虫、水螅、锥虫、真菌、植物以及哺乳动物。

1 RNAi的特征

　　RNAi是发生在转录后水平的基因沉默。

　　dsRNA具有很高的特异性，能特异地将与其同源的mRNA降解。Andrew在植物中用3种转基因诱导的转录后的基因沉默(PTGS)都检测到有约25 nt(nucleotide)长的siRNA(short interference RNA)。Shi Chenyang等从已转染dsRNA的未分化的胚胎干细胞、卵母细胞以及老鼠胚胎细胞的细胞质提取物中都发现有21～23 nt长的siRNA。这些siRNA可能具有指导核酸酶特异地识别靶mRNA 而将其降解的功能，21～23 nt以下的片段还没有发现，由于这些片段不稳定，易被胞内其他核酸酶降解。

　　极低浓度的dsRNA就能完全抑制基因的表达。这可能由于RNA存在复制或由于dsRNA具有很强的催化功能。

　　dsRNA抑制效应具有传递性。Timmons等用含目的基因表达dsRNA载体大肠杆菌喂养线虫， RNA从肠中吸收，但在体细胞及生殖细胞中都有分布表达。此外，RNAi不仅发生在亲代动物本身，其子代伴随基因表达过程也产生了强烈而特异的抑制效应。细胞的这种抑制能力还能在细胞与细胞之间通过胞间连丝传递，甚至可以通过植物的维管组织在整个植物体中传递。Jorgenese等将有共抑制现象的植物作为砧木，没有抑制现象的植物作为接穗，一段时间以后在接穗中产生了共抑制现象。说明有某种信号分子通过植物的维管系统进行传递，由于这种系统获得的沉默具有序列特异性的特点，这种信号分子可能是一种RNA与蛋白质的复合体。

　　dsRNA模板有选择性。对不同目的基因结构序列而合成的dsRNA所产生的抑制效应存在显著差异。Fire等发现，基因外显子编码区的dsRNA能够产生特异和高效的抑制作用，而人对应于内含子和启动子序列的dsRNA不能发生可检测的抑制效应。

2 RNAi的作用机制

2.1 RNAi作用的自我扩增机制

　　Nellen等报道，RNA的作用机制可能类似于反义RNA抑制，以双链中的反义RNA链与同源mRNA通过碱基互补结合，从而抑制其翻译或触发降解机制导致其丰度下降，但这无法解释微量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中的现象。研究者们推测细胞内可能存在RNAi效应的扩增系统。

　　Wassenegger等发现在植物的共抑制现象中，以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-direceted RNA polymerase，RdRP)参与了以病毒为模板的RNA合成。Smardon等发现，EHO-1缺陷型线虫中dsRNA对同源基因表达的抑制作用显著下降，认为在真核细胞中也存在RdRP。在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。

2.2 dsRNA介导的mRNA降解机制

　　研究者猜测，在RNAi作用中dsRNA首先被切割成20～23 bp的小片段，随后这些小片段通过碱基互补直接或间接介导了同源mRNA的降解。随后，Elbashir等通过一系列哺乳动物细胞系的体外实验表明，RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21～23核苷酸长的RNA片段。后者会使同源mRNA被切割为21～23核苷酸长的片段，而非同源mRNAi不被切割，进一步证实了上述观点。在RNAi作用中，可能存在一种核酸酶使dsRNA被切割成双链小片段。Hammond等从已经发生RNAi作用的果蝇S2细胞中部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA，把此酶命名为Dicer酶。Hammond等在纯化该核酸酶时，共分离出21～23核苷酸长的dsRNA片段，该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据Hammond的实验结果，研究者提出一种RNAi作用的简单模型。当dsRNA 导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21～23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA，识别之后，mRNA与dsRNA 的有义链发生链互换，原dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA切割，产生了21～23核苷酸长的 dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，使目的基因沉默，从而产生 RNAi现象。Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员，RNA酶Ⅲ家族是一种能切割双链RNA的酶。 Dicer酶在进化过程中十分保守，在蠕虫、果蝇、真菌、植物及哺乳动物体内都找到了同源基因，它的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。

2.3 RNAi的可能反应机制

　　双链RNA一方面在Dicer酶的作用下被裂解成21～23核苷酸长的dsRNA小片段，这些小片段被称为siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。siRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以siRNA 作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过聚合酶链式反应，细胞内的siRNA增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21～23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

3 RNAi的应用

　　目前基因干涉主要有干涉基因DNA和干涉基因mRNA两种方法。干涉靶基因DNA的方法主要有：①基因敲除细胞分裂时，靶载体与目标基因通过同源重组发生连锁互换，从而破坏目的基因，可进行时空特定性基因敲除；②用合成的寡核苷酸与双链DNA杂交，形成三链DNA，可能通过防止双链DNA解链或抑制转录因子与基因结合，阻止靶基因转录并启动基因修复程序；③采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子与靶基因结合，抑制靶基因转录，但应用此技术时前必须明确转录因子。干涉靶基因mRNA的方式主要有3种：①利用反义RNA技术阻遏翻译过程，破坏内源性 mRNA；②设计寡核苷酸来破坏与mRNA结合的蛋白质，使mRNA不稳定；③双链RNA干涉技术。

　　从应用的角度考虑，RNAi是一种非常有用的基因敲除(geneknockout)方法，用基因打靶来敲除基因的方法费时费力，RNAi是快速、高效、便于操作的使靶基因失活的技术，它能非常有效地鉴定特定基因的功能。随着各种模式生物体基因组计划的完成，生物学家可以非常方便地从大规模数据库中获得全基因组序列，从而找到感兴趣基因的序列，据此设计出使该基因沉默的dsRNA，这是研究疾病机理和鉴定候选药靶的关键步骤，也为将来可控地打开或关闭某一特定基因奠定基础，为疾病的治疗开辟了新途径。RNA干涉理论上能减少病毒感染所需的蛋白质，从而达到减少病毒数量的目的；也可以用来减少某些遗传疾病不正常基因的蛋白质制造量，以治疗该疾病。

　　2002年RNA干涉研究取得了新进展，科学家研究了酵母和四膜虫两种生物体的RNAi现象，发现RNAi对染色体的形状有极大的控制作用。RNAi能永久性关闭或删除一部分DNA，而不只是简单地使DNA暂时沉默。冷泉港实验室的研究人员发现，缺失平常的小RNA的裂殖酵母细胞不能在中心粒正确形成异染色质，从而破坏了正常的细胞分裂。弗吉尼亚大学和罗切斯特大学的研究人员也发现，RNAi能引发四膜虫细胞分裂期间的DNA缺失或序列重组。目前科学家试图确定成百种 RNAi各自的功能，确定哪些物种中含有哪些RNAi以及它们在该物种中的作用。

　　RNAi方法在植物遗传及发育等研究领域得到广泛的应用。拟南芥是植物遗传和发育研究领域很重要的模式生物，Cioppa等用烟草的mosaic病毒导入了几千种不同的遗传序列，系统地进行基因敲除来筛选有用的性状，如抗病或耐旱。Gutterson等敲除了康乃馨的一种激素，使花期延长。多聚半乳糖醛激酶在西红柿成熟时消化细胞壁，Zenera实验室将它敲除后，西红柿可晚一些采摘，味道变得更为鲜美。

　　RNAi是研究信号转导通路的新方法，Clemens等应用RNAi亦研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导通路，在整个实验中发现RNAi技术比传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白非特异性聚集和转染效率不高的缺点，RNAi技术将成为细胞信号转导通路研究的重要方法。RNAi的出现重新唤起了科学家对“RNA世界”的重视和对“生命起源于RNA分子”这一命题的兴趣。有的科学家认为成千上万非编码蛋白质的RNA分子组成了巨大的网络，调节着细胞中的生命活动，它们与蛋白质一蛋白质相互作用网络相对应，将为基因组和生命科学研究提供广阔的前景。
文章来源：东北农业大学学报，2005年第36卷第3期；