丙烯酰胺凝胶电泳

wangyikui

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持
介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。
聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有
格子是带有酰胺侧链的?碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用
比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成
不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子
的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一
般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物
质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含
丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增
加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测
定。
④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。
合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双
丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝
胶。
　　在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和
另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺
成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂
和加速剂的配伍如下表：


聚合反应催化剂配伍

引 发 剂
加 速 剂

（NH4)2S2O8
TEMED

(NH4)2S2O8
DMAPN

核 黄 素
TEMED


注：(NH4)2S2O8，过硫酸胺
TEMED：N，N，N，N'?FONT FACE=\"宋体\" LANG=\"ZH-CN\">四甲基乙二胺
DMAPN：β－二甲基胺基丙晴
　　用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，
称光聚合反应。
聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响：
1、大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气
隔绝。
2、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。
3、某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。
4、温度高聚合快，温度低聚合慢。
以上几点在制备凝胶时必须加以注意。
凝胶的筛孔，机械强度及透明度等很大程度上由凝胶的浓度和交联决定。每100亳升
凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂
占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算：


　

　

　

公 式

a：丙烯酰胺克数； b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）
凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。

交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。
聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三
度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大
小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯
的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本
身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。可通过下式计算来选择适当的凝胶网
孔。

公 式


式中：P为网孔平均直径，C为多聚体浓度，d为该多聚体分子直径（若不是卷曲的分
子应为5A），K为常数，K值取决于涨胶的几何构型，假如多聚体的链是以近似于直角
交联的，则约为1.5根据此式，我们可以通过多聚体浓度C近似地计算出网孔直径，例
如已知多聚体浓度为5%，其网孔平均直径应为：


　

　

　

公 式

这样的计算是粗略的，与实际情况有一定距离，有人测定了总浓度（T）为6.5?FONT
FACE=\"宋体\" LANG=\"ZH-CN\">20%的丙烯酰胺液，在六种不同比例的双丙烯酰胺存在
下，聚合后的网孔大小，发现孔径与总浓度有关，总浓度愈大，孔径相应变小，机械
强度增强，与总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺（Bis)的浓度在5%时孔径最小，高于或
低于此值时，聚合体孔径都相对变大，凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数，它
往往决定了电泳的分离效果。经过不断的实践，得到了如表3?FONT FACE=\"宋体\"
LANG=\"ZH-CN\">3所示的经验值，在一般情况下，大多数生物体内的蛋白质采用7.5%浓
度的凝胶，所得电泳结果往往是满意的，因此称由此浓度组成的凝胶为“标准凝
胶”。


对那些用于重要研究的凝胶，最好是通过采用4?FONT FACE=\"宋体\" LANG=\"ZH-CN\">
10%的一系列凝胶浓度梯进行预先试验，以选出最适凝胶浓度。


　

表3?FONT FACE=\"宋体\" LANG=\"ZH-CN\">3 不同分子量范围的蛋白质和核酸在凝胶电泳
中所选用的凝胶浓度百分率


物 质
分子量范围
适用的凝胶浓度（%）

蛋白质
<10
1-4×104　
4×10-1×105
1-5×105
>5×105
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5

核酸
<104
104-105
105-2×106
10-20
5-10
2-3.6


聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲
液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓
冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨
能力。


蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小
和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大
小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂
十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙
醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白
质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，
因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改
变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物
的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不
再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS?FONT FACE=\"宋
体\" LANG=\"ZH-CN\">聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
胶