转基因

jed-wu

转基因生物和基因打靶
第一节  转基因动物
     
一、概  述
   转基因动物(transgenic animal)是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。转基因动物技术是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，其特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。自20世纪80年代初发展起来后，已迅速、广泛地应用于生物及医学的基础研究、动物育种及基因治疗的探索、基因产品的制备及营养成分的改进等方面。
   20世纪50年代末发展起来的细胞核移植技术，使人们可以从一个细胞中取出整个细胞核(含完整的基因组)并将其转移到去核卵中，此卵可发育、生长成完整的个体，并带有外源性全套基因。随着分子生物学的发屉，20世纪70年代初科学家将分离纯化的DNA和mRNA注入爪蟾卵(英国)和鱼卵(中国)，以研究DNA和RNA的功能。1981年，美国的Brinster和Palmiter用小鼠进行了转基因实验，特大鼠生长激素基因与小鼠(1it／lit)的金属硫蛋白的基因(MT)连在一起，构成MTrGH基固，然后用微注射法注射到小鼠受精卵中，再移植入假孕鼠的子宫中，发育生长，共产出21只小鼠，其中7只带外源基因，而6只体型较原小鼠大一倍左右，即著名的转基因超级小鼠或巨鼠。
目前，转基因动物种类很多，例如：将人凝血因子Ⅸ的基因转入羊的受精卵中制造出能产生人凝血因子Ⅸ的转基因羊，也有人用同样的方法得到了能产生人凝血因子Ⅸ的转基因猪。可见，用转基因动物技术可以产生人类所需的生物活性物质，也可以改变动物的基因型，使其表现型更符合人类需要。
二、基本原理
   转基因动物的摹本原理是将目的基因(或基因组片段)用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因接合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植人受体动物的输卵管(或子宫)中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。
   转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因(即完整的转录单位)。由于哺乳类动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引入报告基因(reporter gene)或报告序列(reporter sequence)。构建外源基因时，可选择适当的顺式作用元件与目的基因(结构基因)拼接；或直接以报告基因作为目的基因与顺式作用元件拼接；也可以将特定的且的基因与报告基因拼接成融合基因(fusion gene)，并与顺式作用元件拼接成完整的基因。顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强启动于(有时包括增强子)，或者直接选用目的基因的天然启动子序列。目的基因可来自基因组片段或cDNA序列。单独以报告基因作为目的基因的目的是研究基因的调控元件。报告基因通常比较容易检测，除了可作为目的基因研究基因调控元件以外，在转基因研究中常用于构建融合基因，通过其在转基因动物中的存在与否来判断目的基因的存在及其表达行为，这可以使检测变得容易而且准确性也相应提高。
三、基本方法
   转基因所用的外源DNA的构型、浓度及纯度等都能影响基因的转移。如线性DNA和环状,DNA均可用于显微注射，但线性DNA整合效率比超螺旋DNA高出数倍，因为线性DNA可以首尾相连，然后整合到染色体上。外源DNA的纯度亦十分重要。完成外源DNA的制备后，导人基因的方式主要有显微注射法、胚胎干细胞法和逆转录病毒感染法。
   1．显微注射法  显微注射(microinjection)是目前最常用的转基因方法之一，其基本原理是用显微注射针将外源基因直接注入实验动物受精卵的原核，使外源基因整合入动物基因组中，从而得到转基因动物。此技术的优点是导入基因的速度快且操作简单，对DNA大小无限制(最大已达250kb)。
   显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序见图12-1。
    图12-1  显微注射法建立转基因鼠的一般实验程序
   受精卵经显微注射后，约有60％左右的卵存活，由此发育成的小鼠中，有10％-40％的小鼠整合有外源基因；其中80％的基因整合发生在单细胞期，成为典型的转基因动物；20％在细胞分裂后整合，这部分动物并不是所有细胞中都有外源基因，称为嵌合动物(chimeric anima1)。外源DNA整合的拷贝数从一至数百个不等，一般情况下在染色体的单个位点整合，有时可能在不同染色体的不同位点整合。外源DNA可以是几个片段首尾相连插入到一个整合位点。例如，线性DNA片段注射入受精卵后，卵细胞内的酶就会将外源线性DNA片段首尾相连，并整合到染色体的一个随机位点中。
   2．胚胎干细胞法  胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞。由于它注射入动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此，可将其作为一种载体，把外源基因导人个体，获得转基因动物。ES细胞可通过磷酸钙-DNA共沉淀法、逆转录病毒感染或电穿孔等方法转染，然后进行筛选和克隆。由于ES细胞能在体外培养，转基因相对较简单。对ES细胞可进行的基因操作包括基因转移(引入新基因)、基因突变(通过插入突变或同源重组定点突变)和基因组改造(对ES细胞的基因组定位修复或修饰)。目前ES细胞的建立和应用只在小鼠取得了成功。
   3．逆转录病毒感染法  将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体，然后将其转染包装细胞，这时，既可以收获重组病毒颗粒，用于早期胚胎的转染，又可以将胚胎直接加入包装细胞培养物中共培养进行转染。转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程。逆转录病毒载体法一般用于分裂后的早期胚胎(8细胞胎)的转基因操作，这尤其对于鸡等家禽类的转基因研究有重要意义，因为鸡受精卵在产出后已发育到桑椹胚期，不可能对其进行显微注射操作。所以，逆转录病毒载体法在培育转基因禽类研究中广泛应用。
   4．精子载体法  通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法获得吸附有外源DNA的精子，然后利用其进行受精，将外源DNA导入卵细胞中，经过胚胎的发育，获得整合有外源DNA的转基因个体。目前，利用此方法进行转基因动物的研究，在国内外均有成功的范例，但是在实践中还存在着分歧，其具体机制尚不清楚，所以仍处于完善和发展阶段。
   5．转基因动物中外源DNA的检测  转基因动物的检测可在不同层次上进行。首先是染色体及基因水平的检测。从转基因个体组织中提取基因组DNA进行斑点杂交、Southern杂交和PCR分析等，以确定转基因动物中是否整合了外源DNA以及整合的拷贝数；还可以利用染色体原位杂交技术进行外源基因整合位点的检测。其次是转录水平的检测。利用Northern杂交、RNase保护分析及RT-PCR方法检测转基因mRNA的存在及表达水平。最后是蛋白质水平的检测，主要是采用Western印迹分析的方法。
四、转基因动物的应用
   目前，科学家们已成功地建立了转基因大鼠、转基因小鼠、转基因兔、转基因猪、转基因羊、转基因牛、转基因鱼、转基因昆虫等。我国的转基因研究起步较晚，但转基因鱼、小鼠、大鼠、兔、猪、羊和牛也已制备成功。
   转基因动物技术在医药、农业及生物学领域都有广泛的应用，主要有以下几个方面： ①对基因组织或阶段特异表达的研究；②通过研究转入外源基因后的新表型，可以发现基因的新功能；③导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，可以发现新的基因；④可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究；⑤建立研究外源基因表达、调控的动物模型；⑥对遗传性疾病的研究；⑦建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据；⑧动物新品种的培育；⑨基因产品的制备；⑩在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。
第二节  转基因植物
   应用转基因技术培育成功的携带外源基因并能稳定遗传的植物就是转基因植物transgenic plant)。目前世界上已获得100多种转基因植物，而且其应用领域也由最初着眼于改变植物本身的性状，如使其具有抗病力、抗药性、抗寒，抗旱性等等，发展到利用转基因植物作为中介工具合成人们所需要的产品，如一些注射疫苗、口服疫苗、抗体及其它药用蛋白等。转基因植物具有广阔的应用前景，被称作“绿色工厂”。
一、基本方法
   建立在组织培养上的植物转基因主要包括组织培养、基因克隆、转基因方法等方面的基本技术。转基因植物的技术路线为：①选择及获得外源目的基因，将目的基因克隆到表达载体上；②受体细胞培养，如培养愈伤组织、悬浮细胞、无菌苗等；③选用适当的转基因方法将目的基因导人受体细胞，可以用纯化的表达载体直接转化；也可先用载体转化农杆菌，再以农杆菌转化受体细胞；④将转化细胞进行适当培养；⑤筛选阳性转化细胞；⑥培植阳性转化植株；⑦转基因植株的鉴定。
   目的基因可来自于植物本身，如抗旱基因；也可来自微生物和动物，如乙肝表面抗原、动物抗体等。利用生物及物理化学等手段，将外源基因导入植物细胞以获得转基因植株，此过程即为植物的遗传转化。近年来，已建立了多种植物的遗传转化系统，其中最常用的是以农杆菌为介导的基因转移方法。农杆菌(agrobacteria)感染双子叶植物时可在被感染的伤口附近形成冠瘿瘤，冠瘿瘤的产生与农杆菌内的一种质粒有关，即Ti质粒(tumor-inducing plasmid，Ti plasmid)，它是一种双链环状DNA分子，约200～250kb。当农杆菌感染植物受伤组织后，Ti质粒上的一段DNA(约为质粒DNA的1/7左右)可被整合到植物的染色体上，这段DNA片段称为转移DNA(transfer DNA，T-DNA)，它的表达产物可破坏植物内源激素的平衡，引发植物肿瘤。如果将表达某蛋白质的结构基因克隆入Ti质粒的T-DNA内，然后用这种重组质粒转化农杆菌，农杆菌感染植物细胞后，导入的外源结构基因可能整合到这些细胞的染色体上，含整合外源基因染色体的植物细胞在一定的条件下可以长成新生的植株。这一植株可以在生长过程中表达外源基因并将这种性状传给子代。这就是Ti质粒介导的植物遗传转化。农杆菌的宿主范围一般仅限于双子叶植物和一些裸子植物，因此，此技术不适用于单子叶植物，如禾谷类作物。
   另外，植物DNA病毒介导的基因转移、电击法、基因枪法、显微注射法、脂质体介导法、多聚物介导法、激光微束穿孔法等DNA的直接转移法也常用于植物基因工程。
   应用一些抗生素抗性基因及抗除草剂基因等筛选标记和报告基因，可对转化植物细胞及转基因植物进行筛选和鉴定，也可经Southern印迹、Western印迹等分子生物学技术直接对转基因植物中的外源基因及其表达产物进行检测。
二、转基因植物在医学上的应用
   用植物基因工程技术生产药用蛋白为生物技术开辟了新的领域，极有希望成为药用蛋白的主要来源和生产方法。以这种方法生产药物有两大优点：第一，植物是真核生物，可在自身细胞内完成蛋白的翻译后加工，使生产的药物更利于人体吸收；第二，大幅度降低生产成本，提高产量。
转基因植物亦可成为新的疫苗来源，特别是适合作为口服疫苗。美国科学家首先用转基因植物表达大肠杆菌耐热内毒素(LT-B)，小鼠口服免疫后，血清和肠粘膜都有抗LT-B的免疫球蛋白，并能中和内毒素。目前，预防肠道疾病，包括霍乱、菌痢的植物口服疫苗正在研制之中。植物病毒也成为人类疫苗的可能来源。因为植物病毒对动物不致病，因此可利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以诱导哺乳动物免疫系统发生反应。
   转基因植物还可以生产单抗，有公司已用转基因大豆生产出单抗BR96，作为化疗药物的靶向载体治疗乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌，目前正处于试验阶段。
三、转基因植物的安全性探讨
   如同所有基因工程制品一样。转基因植物对人和动物的安全性及其对环境的影响问题亦受到世界范围的关注。焦点主要是转基因植物中的外源基因，如耐药基因，尤其是Amp耐药基因，能否进入自然界中的植物或微生物中而产生广泛的耐药性。英国的新食物及加工监督委虽会(ACNFP)认为外源基因有可能从植物基因组转移到人和动物的肠道细菌基因组中。而更多的专家则对此作出了一致的结论：转基因植物中的耐药基因对人和动物的健康无明显危害。其原因有二：①基因从植物转移到细菌几乎是不可能的；②即使发生转移，也不致有临床影响。
   有些学者主张，筛选标记基因(如耐药基因)在转染外源基因的植株筛选时有用，而对植物的生长是无用的，应该在其完成使命后有选择性地除掉。植物可能不只被转化一次而是多次，如果每次转化都在植物中留下一个耐药基因，则很快就难以寻觅到新的无害的耐药基因可以利用。
   展望未来，植物基因工程技术必将继续迅速发展，有重大经济价值的转基因植物将陆续进入大田生产并上市，转基因技术也将更为简单、方便、有效，不久的将来，可望出现集抗虫、抗逆、高营养价值等特性于一身的高产优质作物新种。21世纪的主导农作物将是基因工程产品。作为植物“化工厂”，利用转基因植物生产的药用蛋白及疫苗也将为人类发挥巨大作用。
第三节  基因打靶
   基因打靶(gene targeting)是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除(gene knockout)；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入(gene knockin)。目前这种技术主要在小鼠ES细胞中进行。
   ES细胞基因打靶技术是一项研究基因功能的技术。从20世纪80年代到90年代初，小鼠ES细胞的基因打靶技术已经发展到成熟阶段，用显微注射法已能将小鼠ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠以获得生殖系嵌合体小鼠，经过适当的交配，获得了源于ES细胞的纯系小鼠。目前，这项技术已广泛应用到生命科学各个研究领域中。
一、基因打靶的必备条件
   1．胚胎干细胞  ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第4、5天的胚泡细胞。ES细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。ES细胞体外贴壁生长时的形态特征是：核大，胞浆少，细胞排列繁密，呈集落样生长。ES细胞处于低分化状态时，许多功能基因并不表达，只是一些参与维持细胞增殖和控制分化的基因表达，但在体外培养增殖过程中，ES细胞有一种向多种组织类型分化的趋势。
   ES细胞体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖及正常的核型，同时抑制细胞的分化。将ES细胞进行体外遗传操作后，重新植回小鼠胚胎，可发育成胚胎的各种组织，最后形成嵌合体小鼠(chimeric mouse)。如果这种ES细胞能发育成小鼠的生殖细胞，通过交配就可得到基因敲除或敲入小鼠。
   2．打靶载体  打靶载体含有两种筛选标志：neo(新霉素)阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
   (1)neo阳性筛选标志：将neo基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，nco基因也被插入到染色体，因此，发生同源重组的ES细胞能在含G418的培养基中生长。
   (2)HSV-tk阴性筛选标志：HSV-tk是来源于单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)的胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)基因，此基因产物可以分解单核昔酸类似物而产生毒性代谢产物。将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，载体部分(含HSV-tk基因)是不能被整合到染色体中的。如果细胞能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中；相反，如ES细胞在此种培养基中被杀死，说明载体部分没有插入基因组。
二、基因敲除的基本程序
   通过DNA同源重组，使得ES细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失，然后通过ES细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。
   基因敲除的基本程序包括构建打靶载体、ES细胞的体外培养、重组载体转染ES细胞、重组体转染的ES细胞的鉴定、ES细胞胚胎移植和嵌合体杂交育种。
   1．打靶载体的构建  DNA间发生同源重组的频率是很低的(10-3-10-7)，所以在设计基因打靶策略时，提高同源重组发生频率及引进选择系统是实验成功与否的关键因素。应用同源基因DNA片段构建载体，可以将同源重组频率提高20倍；随着同源臂长度的增加，重组频率也增加。一般每条同源臂的同源顺序长度在250bp以上时，重组效率较高。所以，构建载体时，首先要获得与ES细胞相同品系的基因片段作为同源片段插入载体，并在载体上插入筛选标记基因。
   构建打靶载体的基本过程为(图12-2)：①获得目的基因(待敲除基因)的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。这种由部分残留的待敲除基因的同源片段、位于其内部的neo基因和位于其外侧的HSV-tk基因共同构成的载体即为打靶载体。
2、打靶载体导入ES细胞  将打靶载体导入ES细胞，通过打靶载体上目的基因的同源顺序与染色体上的待敲除基因发生重组置换，以载体上的neo基因置换ES细胞基因组的目的基因，从而得到丧失了目的基因的ES细胞(基因敲除细胞)。一般多采用显微注射法将打靶载体导入ES细胞。
   3、基因敲除ES细胞注射入胚泡  将基因敲除ES细胞注射入胚泡中，使其与原胚泡中的细胞共同组成胚泡的内细胞团。
4．胚泡植入假孕小鼠的子宫中  将含有基因敲除ES细胞的胚泡移植到假孕小鼠的子宫腔中，使ES细胞有机会发育成小鼠或某种组织。这种胚泡中既含有基因敲除ES细胞，又含有胚泡原有的正常ES细胞，因此，这种胚泡发育所产生的后代中有源于基因敲除ES细胞的小鼠，也有源于正常ES细胞的小鼠。
5．嵌合体的杂交育种  对后代小鼠进行筛选，可以得到基因敲除的嵌合体小鼠。一般认为，基因的同源重组只发生在一条染色体上，当一条染色体上的同源基因被同源顺序置换
后，另一条染色体上的等位基因不再发生置换，因此经同源重组后只能得到嵌合体。然后经过杂交育种，按盂德尔遗传规律，其后代中有1／4的几率为纯合子，这样经过将嵌合体小鼠与正常小鼠进行交配，就可得到基因敲除的纯系小鼠，即基因敲除小鼠(如图)。
   基因敲除小鼠  正常小鼠  正常小鼠  正常小鼠
  打靶载体构建及基因敲除流程图
  
三、基因打靶在医学中的应用
   1．基因打靶与遗传病  遗传病是直接由遗传物质发生改变所造成的，如基因突变或染色体畸变等。基因打靶技术最大的优势是能修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传。通过基因打靶途径建立基因缺陷型的遗传小鼠模型(基因敲除小鼠)，是研究疾病的发生机制、分子基础及诊断的主要动物模型。
   2．基因打靶与肿瘤的研究  利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性生长，从而研究肿瘤的发生、转移及转归的分子机制。
   3．基因打靶与生物制药  有公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会和经济价值是无法估量的。
小   结
   分子生物学技术已经能够制备出几乎任何种类的基因并将其插入细胞的染色体中，
使其变成生物基因组中的永久成分。如果用于基因转移的靶细胞是受精卵细胞，就能产
生出转基囤生物。转基因技术使科学家们能够以高度特异的方法改造细胞和生物。转基
因动物和转基因植物都是采用转基因技术使外源基因进入土物体后产生的。如果在胚胎
干细胞中定向地除去某个特定的基因或穆入特定的基因就是基因打靶。基因打靶所产生
的基因敲除小鼠成为研究基因与疾病关系的活试管。
如何选用培养基？

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：
细胞系 细胞类型 种 组织 推荐使用的培养基
293 成纤维细胞 人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清
3T6 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A9 成纤维细胞 小鼠 结缔组织 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮细胞 小鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 肾 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮细胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BT 成纤维细胞 牛 鼻甲骨细胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮细胞 人 结肠腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮细胞 人 肝脏 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮细胞 仓鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮细胞 大鼠 肝脏 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮细胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮细胞 猫 肾 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纤维细胞 猴 肾 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮细胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴细胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴细胞 人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮细胞 仓鼠 肾 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮细胞 人 结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮细胞 人 子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮细胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴细胞 人 早幼粒细胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮细胞 人 纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮细胞 人 结肠腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC 内皮细胞 人 脐带 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml
I-10 上皮细胞 小鼠 睾丸癌 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴细胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮细胞 人 绒毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纤维细胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴细胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴细胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮细胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白细胞 人 红白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮细胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌细胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮细胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 马血清
McCoy 成纤维细胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮细胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素
WEHI-3b 类巨噬细胞 小鼠 骨髓单核细胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮细胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮细胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮肤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮细胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮细胞 小鼠 肾上腺瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
PCR污染与对策


　　PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.
一、污染原因
　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.
　　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染.
　　(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性.
　　还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
　　(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的 检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化 过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简 便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.
二、污染的监测
　　一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.
对照试验
　　1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳 性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.
　　2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.
　　3.重复性试验
　　4.选择不同区域的引物进行PCR扩增
三、防止污染的方法
　　(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定 等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开. 最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.
　　(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸 样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染.
　　(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先 配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一 冰箱.
　　(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.
　　(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病 原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照.
　　(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止.
　　(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前 应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出.
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