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胰岛移植进展及胰岛分离纯化技术[原创]

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发表于 2005-4-1 10:24:52 | 显示全部楼层 |阅读模式
胰岛移植进展及胰岛分离纯化技术
【摘要】目的:确定理想的胰岛分离、纯化技术。方法:采用文献回顾的方法,总结国内外胰岛移植术的现状及其方法学中的新技术、新方案,加以综述。结果:胰岛移植用于治疗I型糖尿病具有不少的优点。然而从世界范围看,目前胰岛移植的结果仍不理想,主要难点在于胰岛素的非依赖性难以长期获得。最近由Shapiro AMJ等人进行的一项研究取得了突破性进展。其成功中的重要一点是制备了高质量的胰岛移植物。随着胰岛的分离纯化技术的发展,胰岛的产量及质量(包括纯度和活力)不断提高;操作方案也逐渐趋于标准化、自动化,使其作为一种治疗方法应用于临床成为了可能。
【关键词】胰岛移植,分离,纯化
Advances in Islet Transplantation and Techniques for Islet Isolation and Purification
【Abstract】Purpose: To identify the optimized techniques for islet isolation and purification. Method: Reviewing the articles to gain a cumulative impression of islet transplantation status of the whole world, and new protocols and techniques. Results: Islet transplantation is a treatment for patients with type I diabetes mellitus with substantial advantages, but the clinical results to date have been disappointing, mainly because insulin independence is rarely maintained long. A recent study (Shapiro et al, 2000)[4] acquired a remarkable success in islet transplantation. Apart from the excellent immunosuppressive regimen, another important factor contributed to their success is the advanced techniques for islet cell preparation. With the development of the methods for islet isolation and purification, higher islet yield and quality (both purity and viability) gradually be obtained. At the same time, the protocols become more standard and automated. Which make islet transplantation a feasible therapy for clinical treatment.
【Keywords】Islets of Langerhans,transplantation,Isolation,Purification

对于严重危害人类尤其是年轻人健康的I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病),目前主要采用外源性胰岛素替代治疗的方法。患者不仅需要终生使用胰岛素,而且经常会发生严重的低血糖反应,甚至出现致命的低血糖昏迷。移植不但是目前根治此病的唯一方法,而且可以降低代谢不稳定性,避免低血糖昏迷的发生,又可以防止多种远期的并发症。近年来,全胰腺移植越来越多地被应用于临床,但它具有较多弊病:它是一种创伤性疗法,目前仍有较高的死亡率;它所应用的免疫抑制方案常会引起严重的副反应。胰岛移植长期以来被认为是一种颇具吸引力的疗法,它不仅操作简便,死亡率极低,又具有反复操作性。故长期以来,许多科研机构都致力于此项研究。在多年动物试验的基础上,人的胰岛移植试验开始于20世纪80年代末,90年代后逐渐成为热点,通过不断改进方法获得了一定的进展,然而总体看来,全世界范围内的研究结果至今仍不甚使人满意,这主要在于胰岛素的非依赖性(insulin independence)难以获得。
国际胰岛移植注册机构(International Islet Transplantation Registry, ITR)2000年9月报告: 在其所统计的自1990年以来世界范围内进行的300多例异体胰岛移植中,获得7天以上的胰岛素非依赖性的患者仅占约15%, 达1年以上非依赖的仅有约10%。(以上并不包括最新的数据)。
但最近,一项鼓舞人心的研究(Shapiro AMJ等人)取得了突破性进展[4]。他们连续进行了7例异体胰岛移植,100%获得了近1年的胰岛素非依赖性。且患者仅出现了极小的胰岛注入副反应。(此项研究并不包括在上述统计中)。其试验方案的特点是应用了一种无糖皮质激素的免疫抑制方案,包括3种副作用小的免疫抑制剂:sirolimus,低剂量tacrolimus和dacilizumab(一种IL-2受体的单克隆抗体)。C. Mathieu, MD, of Leuven, Belgium认为其成功主要源于3方面:(1)应用高质量的胰岛。(2)应用了胰岛β细胞保护剂(如烟酰胺)。(3)对胰岛β细胞无毒害的免疫抑制方案;(未使用糖皮质激素、用IL-2受体的单抗进行诱导治疗、并用低剂量tacrilimus和sirolimus行维持治疗)。
统计数据显示:胰岛移植物的存活率和功能与移植物的量呈正相关。凡获得了较好的移植物存活的患者均接受了至少6000胰岛当量/公斤体重的异体胰岛。获得多个供体胰的患者较单供体胰的患者有更加好的预后。 而新近由Shapiro等人进行的成功研究中,平均胰岛移植量是11547胰岛当量/公斤体重[4]。因而可见,获得足够数量的胰岛移植物对移植的成功起着至关重要的作用。
尽管Shapiro等人的具有突破性的成果第一次证明了异体胰岛移植方法治疗
I型糖尿病的可行性,但异体胰岛移植技术仍是处在试验研究阶段,且面临着诸多问题有待解决。(一)胰岛供体来源缺乏。(二)免疫问题。包括新型有效的免疫抑制方案;免疫耐受的诱导;免疫隔离(如胰岛的微囊化技术);免疫排斥的早期发现等等。(三)胰岛的分离、纯化技术。
胰岛移植若要成为一种有效、可靠的临床治疗手段,首先要依靠先进的分离提纯技术。胰岛移植物的数量和质量(包括纯度、活力等)是胰岛移植成功与否的关键所在。此外,这一步骤的成功也是研究其他步骤的基础。另一方面,分离、纯化技术的标准化、自动化对于其正式成为一种临床治疗方案也是必需的。现就大鼠及人胰岛的分离纯化方法的发展、现状及理想方案叙述如下。
1 大鼠胰岛的分离与纯化
1.1  简介
目前在许多实验室广泛应用的标准化组织切碎消化技术(切碎法)(Standard Chopped tissue digestion process)是在1965年由Moskalevski首创的,随后被Lacy和Kostianovsky改良。这种方法包括:由胰管吹入盐溶液以破坏腺泡组织;切碎胰腺,孵育,并于37℃胶原酶溶液中振荡消化。其中,组织切碎程度、振荡强度、消化终止时机均为防止胰岛损伤的关键因素,使此方法的结果在很大程度上依赖于操作,缺乏一致性。此外,这种方法对胰岛的破坏较大,据统计,应用此法,供鼠胰中最多只有50%的胰岛被保留下来,故要逆转实验鼠的糖尿病状态(约需2000个胰岛/鼠),至少需要4-6个供体鼠。
此后,在狗、猪和人的胰岛移植物制备研究中建立起了胶原酶溶液胰管内注射扩张胰腺,随后温热孵育一段时间的静止消化法。获得了比较理想的胰岛产量。随后这一方法被应用于小鼠及大鼠,进行静止孵育并应用更柔和的分离方法。这种静止消化法不仅提高了胰岛产量,也减少了结果对操作的依赖性,提高了产量的恒定性。
1996年,James Shapiro提出了一种改良型静止消化技术(Modified Stationary digestion technique)[3],并将其与标准化组织切碎消化技术进行了严格双盲的比较,结果显示改良静止法获得了719±114个胰岛/胰腺的产量,高出切碎法的产量(487.5±69个胰岛/胰腺)47.5%;受体体内的胰岛功能方面,静止消化法亦优于切碎法。此外,改良静止消化法节省在大鼠、胶原酶及Ficoll多糖上的开支达26%。其具体方案如下。
1.2 应用改良静止消化法进行胰岛分离与纯化的方案[3]
1.2.1材料:
雄性同系繁殖Wistar-Furth(RT1U)的大鼠,体重250-275g。用为胰岛供体及受体。
诱导糖尿病状态:单次静脉内注射链脲霉素(streptozotocin )65mg/kg体重,大鼠在移植前至少7天时程中非空腹血糖≥18mmol/L 达三次以上。
血糖监测:取毛细尾静脉全血样本,采用便携式血糖仪(Companion II 血糖仪及试纸)。
1.2.2麻醉及手术:
单次腹腔内注射戊巴比妥钠(0.4mg/g体重)。
正中线切口,蚊钳钳于胆管远端入十二指肠处,近端钳于左右肝管分叉以上。用小Iris剪剪开胆管,并于肝管分叉处以下置管(PE50管连接于一只26gauge的针头及注射器上)。用4/0的丝线固定导管,小心避免导管向远端滑出2-3mm以上。
1.2.3改良静止消化法
(1)由胰管所置导管应用脉冲灌注技术注入胶原酶溶液20ml (1mg/mL, Sigma typeⅴ 10H6828), 使胰腺得到最大扩张。注意:扩张胰腺时需抬高脾脏,使胰尾得以扩张理想。
(2)完整切除胰腺并保存于冰浴的T型长颈瓶中,冰浴30min。
(3)静止消化(37℃)35分钟。
(4)制备物移入50mL试管(Falcon, Becton Dickinson),加Hank’s 平衡盐溶液(HBSS)(其中包含青霉素、链霉素和右旋糖)至20mL。应用电涡旋仪(Vortex Genie, Scientific Industries Inc., NY)于1500rpm(600×g)离心5秒(使胰岛与粘著的腺泡组织分离)。注意:准确加液至20mL。
(5)吸出残余的脂肪等结缔组织,胰岛小球加入HBSS洗涤并离心(1000rpm 400G)5秒,共2次。
(6)通过网眼850m的滤器过滤。残余组织通过18gauge针头连接的20mL注射器加入HBSS喷射破碎。
(7)滤过组织再次于1500rpm(600×g)离心5秒。 1.2.4纯化(间断的密度梯度离心)
(1)  组织再悬浮于10mL的25% Ficoll。
(2)  应用25,23,20.5,11%的Sigma Ficoll 400-DL(配于含有HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)的HBSS中)(12mL HEPES : 500mL HBSS)进行间断密度梯度离心:2000rpm, 800×g,15分钟。
(3)  由上2层界面回收胰岛组织,再悬浮于界质199 (Medium199, M199),并倒入50mL试管。
(4)  再次短时间于Ficoll中离心(2000rpm, 800×g,5分钟)以提高胰岛纯度。
(5)  由上2层界面回收胰岛组织,以M199洗涤3次。
1.2.5评估产量
应用双筒解剖镜(×25),绿色背景,白光照明,记数直径≥100m结构完整的胰岛。应用目测方格尺(Wild Leitz, Willowdale)测量胰岛大小。
并挑选胰岛进行活力及功能测定。
1.2.6体外评估胰岛活力(Lacy等人的灌注技术)
(1)  选出相当于200个胰岛当量的胰岛,于标准PMRI1640培养基中过夜培养。
(2)  将200当量的胰岛移入一小缸,并用含不同浓度葡萄糖的PRMI1640培养液(Gibco)进行灌注:2.8mmol/L 第一小时,28mmol/L 第二小时,2.8 mmol/L 第三小时。分别在以下时间点留取流出液标本,并应用胰岛素双抗放免分析法测定其中胰岛素含量:51, 59分钟(低葡萄糖环境);65, 69, 89, 109分钟(高葡萄糖环境);149, 179分钟(低葡萄糖环境)。
(3)  计算刺激指数(Stimulation Index,SI):高糖暴露时的平均胰岛素释放量/前后两次低糖暴露时的平均胰岛素释放量
(4)  计算刺激曲线下面积(Stimulated Are a Under the Curve,SAUC)。
1.2.7异体移植
(1)  2000个胰岛行肾包膜下移植术植入实验性糖尿病大鼠。
(2)  测定非空腹毛细尾静脉血糖(第1周每日1次;此后每周3次直至试验结束)。
1.2.8胰岛功能的体外评估
(1)  静脉血葡萄糖耐受试验(Intravenous Glucose Tolerance Tests, IVGTT),于移植后1个月时进行。
(2) 结果通过K-评估与同种系正常(非糖尿病)大鼠相比较。
(3)  全麻下行股静脉及动脉置管,以便行弹丸式葡萄糖注入(0.5g/kg 50%右旋糖)并分别取样。
(4)  结束糖耐量试验后,含移植物的肾被切除,进行组织化学检查。大鼠仍维持存活24小时以除外糖尿病状态的自发缓解。
1.2.9统计分析
每个胰腺的胰岛产量用平均值±SD表示
刺激指数(SI)
移植后正常血糖维持时间
静脉血葡萄糖耐受试验(IVGTT)
2  人胰岛的分离与纯化方案
2.1简介
自20世纪80年代末开始人胰岛移植试验后,人胰岛的分离纯化方案不断改进,并逐渐趋向标准化、自动化,力求获得更高的胰岛提取效率,提高胰岛制备物的纯度、活力,并提高结果的一致性。
人胰岛分离技术,由最初的机械破碎发展到静止消化,再到应用连续消化装置(CDD)的自动胰岛分离(Camillo Ricordi等)[2],直至JR. T. Lakey等人创立出自动计算机控制胰岛分离[10]。
人胰岛纯化技术,由间断密度梯度离心发展到应用血细胞分离系统的连续密度梯度离心。方法逐渐自动化,减少了人为因素所致的结果不恒定性。
另外,由于试验条件各异,胶原酶等生物试剂的纯度及活力存在着较大的组间差异,诸多因素使各实验室在方法学的许多方面仍存在不同的经验和看法,有待进一步比较与探讨。例如:用于纯化的界质,目前常用的有多糖类(Dextran, Ficoll, Ficoll-conray)、牛血清白蛋白(BSA)、明胶几种。有些看法认为Ficoll成分具有胰岛毒性,会降低胰岛活力,另一些则认为与含有异体蛋白的牛血清、明胶相比,Ficoll的效果更为理想,又不会激发免疫反应。在胶原酶等试剂的剂型选择及剂量方案上,各实验室亦有不同的经验。但随着标准化方案的发展,较理想的统一方案会逐渐出现。
通过总结国内外近年经验,现将一种较为理想的人胰岛分离纯化方案[1]的具体步骤介绍如下,同时列出可供参考的替换方案。
2.2胰岛分离与纯化的具体步骤
2.2.1胰腺获取及处理
(1)  脑死亡胰腺供者。原位血管(如腹主动脉)内灌注冷冻的UW 溶液(Wisconsin University solution)(4℃),作为多器官采摘的一部分。---Ohzato H认为应在获取胰腺的同时行1mg/mL的胶原酶溶液(Hank’s平衡盐溶液配制)灌注胰管,而不宜血管灌注保藏液[11]。
(2)  完整切除胰脏(注意勿阻塞液体由脾静脉流出)。
(3)  保存于冷冻的UW 溶液(4℃)  --- Ricordi C, 1989年的方案中用Eurocollins溶液[2];Ohzato H认为UW,MS等细胞内型保藏液影响消化过程,主张用细胞外型保藏液,如Hank’s平衡盐溶液(HBSS),PPF。
(4)  小心除去脂肪、淋巴、血管及其它结缔组织
(5)  称重
(6)  将主胰管由胰体中央切开,一根16gauge导管由中央切断,分别向胰头、胰尾方向插入主胰管,一根14gauge由中央切断的导管插入胰头,并用3/0的丝线绑系固定。
2.2.2冷冻胶原酶灌注胰管
(1)  胶原酶制备: 取冷藏(-80℃)Liberase TM-HI酶的小瓶(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN),温热至室温。再悬浮于15ml冷冻的(置于冰上)Hank’s平衡盐溶液(HBSS)(Gibeo, Grand Island, NY)---(或Sigma, St. Louis, Mo),使之再水化30分钟。加HBSS至500ml,无菌滤器(0.22μm醋酸纤维)过滤,得到纯化胶原酶混合液。---Ricordi C在1989年方案中用Ⅹ型胶原酶(Sigma)2mg/mL。[2]
(2)导管内酶溶液灌注:(以保持导管的完整性,使胰腺完全膨胀)
A.控制灌注方案
(1)  将胰腺置于用户化的灌注装置中(用冷的胶原酶混合液进行循环灌注)
(2)  采用标准灌注方案:
前5分钟:持续60-80mmHg
后5分钟:持续160-180mmHg
共10分钟冷灌注,然后将循环系统中的胶原酶溶液逐渐升温至35℃
(3) 扩张的胰腺及胶原酶溶液被送至连续消化装置(CDD)进行机械及酶分离…
B. 注射方案(标准注射灌注方案)
(1)  胶原酶溶液预热至28-32℃。
(2)  60ml注射器吸取胶原酶溶液,平均分配注入3个导管内(用最大手劲,使压力>300mmHg)。
(3)  扩张的胰腺和全部漏出的胶原酶溶液送至连续消化装置(CDD)进行机械和酶分离…
2.2.3 胰岛分离
(1)  将胰岛放入连续消化装置(CDD)[2]的消化罐中,加入纯化的胶原酶混合液2mg/mL;盖上筛网,密闭消化罐。
(2)  打开振荡器(设为320次振动/分钟)。
(3)  打开蠕动泵(设为40ml/min)。
(4)  经循环,使消化罐中的胶原酶溶液缓慢升温(平均每分钟升高1℃),至37℃ 时维持于37±0.5℃。
(5)  连续消化中进行评估:每2分钟取样镜检一次,当出现游离胰岛时,停止循环(短路再循环圆筒及加热回路);以200ml/min的流速将胰岛分离物收集于2升的盛有HBSS的烧瓶中(4℃,开放系统) 从而使胰岛分离物逐渐降温并被稀释,以防进一步被酶破坏;200ml/min可迅速更新消化罐中的溶液。
(6)  30-60分钟以后,当样本中不再出现胰岛时 即大部分胰岛与外分泌组织分离时停止消化。
(7)  用37℃ HBSS冲洗消化罐,HBSS中含有10%的新生小牛血清(Hyclone, logan, UT)及抗生素(如青霉素、链霉素)。---Shapiro AMJ认为分离及纯化过程中均不宜应用异种血清,故以25%人血白蛋白代替小牛血清。
(8)  流出溶液流经玻璃冷凝柱冷却并收集于2升的烧瓶中(4℃环境)(Ricordi C, 1989年方案)。---Lakey JRT在1999方案中收集于500ml圆锥形试管。
(9)  1500 r/min离心,所有组织再组合,得到胰岛消化物。
(10)  取一定量的纯化前样本,用Dithizone( 二苯硫卡巴腙,双硫腙,DTZ)染色并评估…
2.2.4胰岛纯化
(1)  用连续梯度的Ficoll泛影酸(Seromed-Biochrom) 在IBM2991细胞分离装置(Cobe实验室,Lakewood, CO)中进行纯化。[1]
(2)  在连续几层(10至15层)中取样,Dithizone染色并评估胰岛纯度。
(3)  取一定量的样品作为纯化后的样本.
---Dextran密度梯度离心为目前Ficoll的常见替代。
---Ricordi C于1988年方案中应用间断梯度的Ficoll(Sigma)密度梯度离心。 [13]
---Lake SP于1989年方案中应用间断梯度的牛血清白蛋白(BSA)密度梯度离心。[12]
2.2.5样本的胰岛计数与纯度计算
样本计数与纯度评定均由2个各自独立的研究者进行
A.  数量:用一种理想的量板计数每一个直径等级的胰岛数目。
(1)  将胰岛分为4个直径等级:50-100,100-200,200-300,>300(μm )(不计数<50μm的胰岛组织)。
(2)  每一直径等级的胰岛数量被换算为以IE为标准的数量(胰岛被假设为球形以计算体积)。
胰岛当量(Islet Equivalents,IE):样品中相当于直径150&#61549;m胰岛的胰岛数量。
B.纯度:
比较: 双硫腙染色的组织(内分泌组织)
        未染色组织
2.2.6胰岛生存力评估
(1)  纯化后,胰岛小球结合在一起。
(2)  37℃悬浮于200mL的组织培养基CMRL-1066(包含:10%小牛胎儿血清,100u/mL青霉素,L-谷氨酰胺(2mM),HEPES(25Mm), 并用NaOH调节pH值至7.4)。---Ricordi C于1989年所用方案。
(3)  在潮湿空气(95%空气, 5%二氧化碳)培养24小时。
(4)  葡萄糖刺激试验(评估胰岛功能)
取双份已知量的胰岛样本分别在:
 低浓度:50mg/dL(2.8mmol/L) 葡萄糖
高浓度:360mg/dL(20mmol/L) 葡萄糖
培养液中,37℃的二氧化碳培养箱中孵育2-4小时,分别测定(间接放射免疫法)高浓度葡萄糖刺激下培养基中产生的胰岛素量(A)及低浓度葡萄糖刺激下产生的胰岛素量(B)。
胰岛素刺激释放指数(Stimulation Index, SI):A/B
三.总结
胰岛移植被认为是治愈I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病)的一种颇具潜力的疗法,但它仍处于试验阶段。从世界范围内的研究看,其结果目前仍不理想,主要难点在于胰岛素的非依赖性难以长期获得。最近由Shapiro AMJ等人进行的一项研究取得了突破性进展。他们连续进行的7例人胰岛移植100%获得了近1年的胰岛素非依赖性。从而第一次证明了异体胰岛移植方法治疗I型糖尿病的可行性、可靠性。其成功主要源于3方面:(1)应用高质量的胰岛。(2)应用了胰岛β细胞保护剂。(3)对胰岛β细胞无毒害的免疫抑制方案。但异体胰岛移植仍面临着诸多问题有待解决。其中,高质量的胰岛移植物的获得是其关键。
胰岛移植物制备技术的发展,使胰岛的数量及质量(包括纯度和活力)不断提高,从而使应用2个供体胰/受者进行成功移植成为可能。另一方面,方案逐渐趋于标准化、自动化,使之在成为一种临床疗法的道路上更进一步。
具体方案上讲,作为基础研究领域中重要方面的大鼠胰岛的分离和纯化,目前普遍使用的消化法仍是组织切碎法。这种方法对胰岛的破坏性较大,限制了胰岛产量的增加。其后,在狗、猪和人的胰岛移植物制备研究中建立起了胶原酶溶液胰管内注射扩张胰管,随后温热孵育的静止消化技术,获得了较为理想的胰岛产量。1996年,Shapiro AMJ提出了一种改良型静止消化技术,获得了719±114个胰岛/胰腺的产量,且有较高的纯度即胰岛活力。
人胰岛移植试验开始于20世纪80年代末,其分离纯化技术不断进步,逐渐获得了更高的胰岛提取效率及胰岛质量。并使方案逐渐标准化、自动化,提高了结果的一致性。
由于诸多条件不同,各实验室在试验方案中仍有不同做法和经验,有待进一步试验加以比较、完善。以逐渐摸索出理想的方案。
总之,胰岛移植是一种很有前途的I型糖尿病的治疗方法,国际上已有成功结果的报告;但目前仍需在方法学的诸多方面进一步研究、完善。

[参考资料]
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[2]  Ricordi C, Lacy PE, Scharp DW. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes, 1989;38:uppl.1:140-2.
[3]  Shapiro AMJ, Hao E, Rajotte RV, et al. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion-a comparison with standard technique. Cell Transplantation, 1996;5:6:631-38.
[4]  Shapiro AMJ, Lakey JRT, Ryan EA, et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med,2000;343:230-8.
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[9]  第三临床学院内分泌科,姚文华,王清,张健中。成人胰岛的分离及纯化。白求恩医科大学学报,1996;22:658-60。
[10]  Lakey JRT, Warnock GL, Brierton M, et al. Development of an automated computer-controlled islet isolation system. Cell Transplantation, 1997;6:47-57.
[11]  Ohzato H, Monden GM, Kanai T, et al. Intraductal injection of collagenase solution at the time of harvesting: a possible solution for preservation and collagenase digestion. Transplantation Pro, 1990;22:782-3.
[12]  Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, et al. Automated Method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes, 1988;37:413-20.
[13]  Lake SP, Bassett D, Larkins A, et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes, 1989;38:suppl.1:143-5
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