PCR基础

zbattery

分子生物学技术正以惊人的速度发展，特别是近20年来已经成为生命科学的一个主要的生长点。1976年cDNA克隆技术的建立，使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科，发展了各学科的分子理论基础。1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应（ PCR， Polymerase Chain Reaction ），使一向昂贵、繁杂、严格的分子生物学试验能够在比较简易、经济的条件下有效的开展，是基因分析技术的一项重大突破。这一技术在很短的时间里即风行全球，不同学科的科学家都蜂拥而上，在近年形成了分子生物学领域的热潮，期望凭借这一工具来提高研究水平，解决所面临的一些难题。
　　早在四十年以前人们对遗传基因的化学本质并不清楚，后来发现脱氧核糖核酸（DNA）是遗传信息的主要载体。DNA的基础构成单位是核苷，核苷的排列顺序规定遗传密码并形成了基因。DNA是双螺旋结构，以半保留的方式进行复制的（Warson, 1953），1958年Meselson证实了DNA半保留复制模型。60年代对基因表达和调控研究又取得很大进展，从细胞中分离目的基因并在体外克隆和表达受到人们的普遍关注。由于对DNA连接酶及限制性内切酶的合理使用，DNA重组到质粒或噬菌体载体中，在细菌中表达成为70年代基因克隆的最常用技术。Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA的设想，由于当时不能合成寡核苷酸及DNA测序等困难而受阻。直到1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary. B. Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。Saiki首次描述利用PCR方法扩增人珠蛋白DNA，并用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
　　Mullis最初建立的PCR方法使用三种温度的水浴进行实验，所用大肠杆菌DNA聚合酶I的KLENOW片段催化复性引物的延伸，由于该酶不能耐受使DNA变性的高温，所以每一轮反应都需添加新的酶，产量不高且操作繁复，对实验操作要求较高，无法推广使用。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。由于Taq酶能够耐受97.5℃加热5-10分钟，因此使DNA变性的94℃加热不使其失活，整个反应只加一次酶即可，并且高温反应也增加了扩增的特异性和效率，易于自动化进行。Mullis因其杰出的贡献，1993年获诺贝尔化学奖。
　　PCR技术能快速特异地在体外复制目的，理论上能将其量极微的（fg DNA）目的基因在较短的时间内（1-2小时）扩增到极易检测的微克水平。PCR技术目前已经成为人们获得目标基因的最常用的方法之一。然而其基本原理并不复杂，主要包括模板DNA（目标DNA）加热变性；降温后反应混合物中特异性引物与单链DNA模板的复性；72℃条件下，Taq酶诱导引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一轮反应，模板拷贝数都增加一倍，理论上n次循环后，扩增产物拷贝数为2E(n－1)。但在PCR反应后期由于底物的消耗，Taq酶活力的下降，PCR抑制物的增加，PCR反应的指数形式逐渐转化为线性形式进入扩增的平台期，实际上30-35个循环，扩增倍数一般可达百万倍。如果想再提高扩增产物的量，可以将产物DNA再稀释1000倍作为新的模板进行第二轮的PCR扩增，一般二次扩增后的DNA数量已达到所有分子生物学操作的要求。
　　一、 变性，DNA双螺旋结构的生物功能在于复制与转录，加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为DNA变性。解除条件后，变形的单链DNA可以重新结合起来，再形成双链，称之为DNA复性，又叫退火。DNA双链离解一半时温度称为解链温度（Tm）。不同DNA的解链温度不同，取决于DNA中G-C与A-T的含量的区别。G-C间有三个氢键，A-T间有两个氢键，因此G-C比例大的DNA片段解链温度高，一般，G-C含量每增加1％，PCR变性温度增加0.4℃。Tm范围通常一般在85-95℃之间，PCR变性温度选择94℃，变性时间为30秒到2分钟。
　　二、 退火，PCR反应体系的退火其实是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。一般引物是人们根据目标DNA的序列人工合成的，其长度在15-30碱基之间，引物的设计有一定的原则，但完全达到理论要求的理想引物，几乎不存在。通常反应体系中包含两个引物所对应的模板区间的DNA片段。由于引物的浓度大大地超出体系中模板的浓度，所以变性后，系统温度降低，首先是引物与单链模板DNA结合，形成局部双链，而不是原来的两条单链模板DNA再结合形成的完整的双链。
　　三、 延伸，PCR中链的延伸是有方向的，以引物为起点，从5’端到3’端延伸，这是由DNA聚合酶（Taq酶）决定的。Taq酶具有DNA多聚酶的核心功能—以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以Watson-Crick配对方式按5’—3’的方向，沿着模板顺序合成新的DNA链。Taq酶催化DNA合成的温度以70℃—80℃为宜，此时该酶的Kcat值为150核苷/秒/酶分子，55℃为24核苷/秒/酶分子，37℃为1.5核苷/秒/酶分子，22℃为0.25核苷/秒/酶分子。高于90℃时DNA合成几乎不进行。Taq DNA多聚合酶具有依赖DNA合成的5’端到3’端外切酶活性。但不会影响PCR扩增。Taq酶没有3’端到5’端外切酶活性，所以如果发生脱氧核苷酸的错误掺入时，这种酶没有校正能力。Taq酶对Mg2+离子浓度较为敏感，1.5－2.0mM条件下酶活性最高，许多生物变性剂对酶活性有不同程度的影响。PCR扩增DNA特定区段，是由人工合成的两条寡核苷酸引物所决定的，这是PCR扩增的理论关键。
　　PCR技术以其自身巧妙的原理有与众不同的特点，高特异性、高敏感性及简便快捷使其成为基因诊断首选的技术之一。
　　一、 高特异性，PCR扩增严格遵守碱基配对原则的半保留复制。半保留复制是世界上最严格的复制方式之一，其新合成的子链与模板形成完全互补的镜像结构，从而充分保证了复制的准确性。另外，由于碱基互补原则，只有当引物与目的基因完全互补时，反应体系中的引物才能与模板产生复性，引物的延伸才得以进行，因此引物与模板的互补是复制的最基本条件，这从另一方面规定了PCR反应的高特异性。在生物界中，某种基因总有它最保守的、最具特征性的基因区段，它是某些生物，或某些型、亚型等功能分型所特有的。若能正确地选择这一区域作为扩增的目的基因，便可以充分地保障PCR检测的高度特异性。
　　二、 高敏感性，在PCR反应中模板DNA以指数级迅速增加，扩增反应前期进入以指数级迅速增加，扩增反应后期进入平台反应期，一般经过30个循环即1－2小时内可以将靶序列增加百万倍以上，可以将微量的目标物（fg DNA）检测出来。过去采用的一些微量检测法，如酶联免疫吸附实验（ELISA）和放射免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng级和pg级，而PCR可达fg级，理论上可以检出病原体的单拷贝基因的存在。
　　三、 简便快捷，Taq酶的使用使PCR技术可以自动化完成，各种高效PCR仪相续问世使PCR操作可以在基层单位的实验室中顺利完成。在PCR的实际应用中，许多技术得到改进，扩增反应体积减少，多种成分预先混合减少加样步骤，这些简化步骤大多不影响PCR的扩增效果。特别是本公司率先研制的单管单人份的PCR试剂，使操作者节省时间精力，而且又不易污染，充分满足了临床快速诊断的要求PCR技术对样品要求低，不必严格纯化模板DNA，几乎所有的临床样本都能用于PCR扩增，本公司设计的一步法提取模板使临床PCR检测更加简便易行。
　　PCR局限性，由于Taq酶缺乏3’端到5’端外切酶活性，因而不能纠正反应中发生的错误的核苷酸掺入，复制的新的DNA链中有一定程度的错配碱基，估计错配率为9000个核苷有一个错配，41000个核苷酸可能导致一次码移位。然而错配碱基有终止延伸倾向，这使错配的DNA片段不会进一步扩大。另外，PCR要求比较严格，容易出现实验污染或操作污染而出现假阳性结果。同时如果扩增仪温度不准确，反应液处理不好导致PCR抑制物进入反应体系又会出现假阴性结果。因此在开展PCR工作之前，有关人员最好能经过系统的学习及规范化的基本技能培训过程。
　　PCR技术问世以来正以惊人的速度发展，不仅其本身不断地优化改进，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现。在PCR技术的启发下，诸如转录依赖的扩增系统（TAS）、连接酶链反应（LCR）、自主序列复制系统（3SR）、链替代扩增（SDA）、循环探针反应、等温扩增系统等核酸体外扩增技术不断诞生。当然，目前Mullis发明的经典PCR技术，仍是多数实验室进行核酸体外扩增时的首选和最常用的技术。