第三节：蛋白质的分子结构
一、蛋白质的一级结构
二、蛋白质的二级结构和纤维状蛋白
三、蛋白质的三级结构
四、蛋白质的四级结构
蛋白质的结构
蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。
蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。
蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。
一、蛋白质的一级结构
1. 定义—— 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。
2.蛋白质一级结构的测定
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。
（1）测定蛋白质一级结构的要求
a、样品必需纯（>97%以上）；
b、知道蛋白质的分子量；
c、知道蛋白质由几个亚基组成；
(2) 测定步骤
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
（2）测定步骤
B.多肽链的拆分。
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。
( 2) 测定步骤
B.多肽链的拆分。
几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
(2) 测定步骤
C.二硫键的断裂
几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
(2) 测定步骤
可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。
巯基（-SH）的保护
(2) 测定步骤
D.分析多肽链的N-末端和C-末端。
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。
在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。
Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。
在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。
此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。
根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。
最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。
羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。
目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。
羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。
（2）测定步骤
E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。
酶解法:
胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶
Trypsinase ：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。
或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。
R2=Pro 水解受抑。
Pepsin：R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。
R1=Pro 水解受抑。
thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。
R2=Pro或Gly 水解受抑。
R1或R3=Pro 水解受抑。
谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液); R1=Glu (磷酸缓冲液或醋酸缓冲液)
精氨酸蛋白酶： R1=Arg
化学法：可获得较大的肽段
溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。
化学法：可获得较大的肽段
羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。
（2）测定步骤
F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。
Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。
测定每条多肽链的氨基酸组成
（2）测定步骤
G.确定肽段在多肽链中的次序。
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
示例(十肽的水解)
A法水解得到四个小肽：
A1 Ala-Phe
A2 Gly-Lys-Asn-Tyr
A3 Arg-Tyr
A4 His-Val
B法水解得到四个小肽：
B1 Ala-Phe-Gly-Lys
B2 Asn-Tyr-Arg
B3 Tyr- His-Val
（2）测定步骤
H.确定原多肽链中二硫键的位置。
一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。
将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。
一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。
将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。
然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。
蛋白质的一级结构
3.蛋白质一级结构举例
（1）胰岛素（Insulin）
二、蛋白质的二级结构与纤维状蛋白
（一）构型与构象
1.构型（configuration）：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。
COOH COOH
H2N C H H C NH2
R R
2.构象（conformation）:指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。
二、蛋白质的二级结构与纤维状蛋白
（二）蛋白质的构象
一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH条件下，只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物学活性，并且相当稳定。这一事实说明了天然蛋白质主链上的单键不能自由旋转。
（二）蛋白质的构象
蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现：
1.肽键具有部分双键性质：C-N单键键长0.149nm
C=N双键键长0.127nm
肽键键长0.132nm
2.肽键不能自由旋转
3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个碳原子 （C）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane）。
二面角的概念
蛋白质中非键合原子之间的最小接触距离(A)
Ramachandran构象图
Ramachandran构象图
（二）蛋白质的构象
蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现：
1.肽键具有部分双键性质：
2.肽键不能自由旋转
3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个碳原子 （C）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane）。
4.二面角所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中，非键合原子之间的接近有无阻碍。
(三) 蛋白质的二级结构
蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链的主链本身在空间的排列、或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。氢键是稳定二级结构的主要作用力。
主要有-螺旋、-折叠、-转角、自由回转。
1.-螺旋及结构特点
多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;
肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。
蛋白质中的-螺旋几乎都是右手螺旋。
1.-螺旋（-helix ）
-螺旋是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构。
-螺旋中每个残基（C）的二面角和各自取同一数值，即=-57、 =-48 。
-螺旋有左手和右手螺旋，蛋白质中的-螺旋几乎都是右手螺旋。
-螺旋都是有L-型氨基酸构成的（Gly除外）。
-螺旋的形成及其稳定性与其氨基酸组成和顺序有关（Pro、polyLys、PolyIle、PolyAla）。 -螺旋折叠过程中存在协同性。
-螺旋的书写形式为：3.613-螺旋
2.-折叠（-pleated sheet）
-折叠或 -折叠片也称 -结构或 -构 象，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。
-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象
2.-折叠的特点
-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链间氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。
-折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。
3.-转角(-turn) 亦称： - reverse turn, -bend
在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;
弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 –N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。
这类结构主要存在于球状蛋白分子中。
4.无规卷曲或自由回转（nonregular coil）
指无一定规律的松散盘曲的肽链结构。
酶的功能部位常包含此构象，灵活易变。
（四） 超二级结构
1.超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位（-螺旋或-折叠或-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。
2.超二级结构的基本类型：、 、
纤维状蛋白
纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外表保护成分， 占脊椎动物体内蛋白质总量的一半成一半以上。
这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴／短轴)大于1()(小于10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肽链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。
纤维状蛋白质的类型
纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白)和可溶性两类，前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等；
后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等，但不包括微管(microtubule)和肌动蛋白细丝(actin filament)，它们是球状蛋白质的长向聚集体(aggregate)。
角蛋白 Keratin
角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。角蛋白中主要的是-角蛋白。
-角蛋白主要由-螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手-螺旋肽链形成一个原纤维（向左缠绕），原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性
例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。
-角蛋白的伸缩性能很好，当-角蛋白被过度拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时-角蛋白转变成-折叠结构，称为-角蛋白。
毛发的结构
一根毛发周围是一层鳞状细胞(scaIe cell)，中间为皮层细胞(cortical celI)。皮层细胞横截面直径约为20m。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。
毛发性能就决定于—螺旋结构以及这样的组织方式。
角蛋白分子中的二硫键
卷发(烫发)的生物化学基础
永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),—角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为—构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。
这是因为—角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在—构象状态，此外—角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(—螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。
（2）-角蛋白
丝心蛋白(fibroin)：这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。丝心蛋白是典型的反平行式-折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象。
丝蛋白的结构
丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向-折叠结构。分子中不含-螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：
-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-
三、蛋白质的三级结构
1.蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。
结构域：指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上，进一步卷曲、折叠形成几个相对独立、近似球形的三维实体。
2.维持三级结构的作用力
氢键
范德华力
疏水键（疏水相互作用）——在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。这一现象称为疏水相互作用。
离子键（盐键）
二硫键
疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。
2.维持三级结构的作用力
3.肌红蛋白的结构与功能
（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。
（2）肌红蛋白的结构特点：1963年，Kendrew
a .一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600。
b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段较直的-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。
c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。
血红素（铁卟啉 ）辅基的结构及其氧合部位
煤气中毒的机制
一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红素的结合能力是O2的200倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。
（3）肌红蛋白的氧合曲线
Y=
肌红蛋白的氧合曲线
Hill曲线：
四、蛋白质的四级结构
四级结构是指由两 个或两个以上具有三级结构的亚基按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。
通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。
亦可以说，具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白或多体蛋白。（寡聚蛋白中亚基可以是相同的或不相同的，亚基相同时，分子具有对称性）
实质：蛋白质的四级结构实际上研究亚基之间的相互作用、空间排布及亚基接触部位的空间布局。
2.维持蛋白质四级结构的主要作用力
在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。
即亚基之间通过次级键彼此缔合在一起（二硫键？）
疏水键是最主要的作用力。
3.血红蛋白的结构与功能
（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH.
（2）血红蛋白的结构特点：
a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000
b.成人的血红蛋白为22（HbA-96%）、22（ HbA2-2%）胎儿的血红蛋白为22（HbF）
c.  链由141AA残基组成，    链由146AA残基组成。
四种肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。
（3）氧合引起血红蛋白的构象变化
别构蛋白的结构特点
都是寡聚蛋白质，有四级结构.
分子中每个亚基上都有活性部位，或者还有别 构部位；某些蛋白质的活性部位和别构部位分属不同的亚基。
不同亚基各部位之间存在相互作用，部位之间的影响是通过构象变化传递的.
同种效应
（homotropic effect）
B.氧合引起的血红蛋白的构象变化
非氧合蛋白中四个亚基间的相互作用
O- O-
C O
HC O P O-
HCH O-
O
O P O-
O-
与氧结合时血红蛋白的变构过程
血红素中铁原子的变化
高自旋状态 低自旋
（非氧合，原子半径较大） （氧合，原子半径较小）
与氧结合时血红蛋白的变构过程
亚基三级结构及整个蛋白四级结构的变化
T构象 R 构象
C. 血红蛋白的氧合曲线
血红蛋白的氧饱和度（Y）定义为：
Y=
血红蛋白S形氧合曲线的生理意义
D. H+、CO2和DPG 对血红蛋白结合氧的影响
氧亲和力：指血红蛋白对于氧的结合牢固程度，表示为PO （P50）。（在一定氧分压下，氧亲和力越高，即氧结合越牢固。相反，氧亲和力越低，组织就能得到更多的氧供应）
DPG的影响：
HbO2Hb(O2)2Hb(O2)3
Hb-DPG  Hb(O2)4+ DPG
DPG降低血红蛋白亲氧能力的重要生理意义： DPG是红细胞中存在的糖代谢中间产物。当血液流经O2分压较低的组织时，红细胞中的DPG可促进氧合血红蛋白释放氧，以满足组织对O2需要。 DPG浓度越大， O2的释放量越多。红细胞中DPG浓度的变化是调节血红蛋白对氧亲和力的重要因素。实例：在高山上；肺气肿病人；储藏血液。
E.胎儿血红蛋白的氧合能力大于HbA
胎儿血红蛋白（HbF）为22，而成人血红蛋白(HbA)为22，
与的区别为： 143—His
(DPG与亚基的结合部位：
Val1--NH3+
Lys82--NH3+
His143-咪唑基)
143——Ser，使HbF与DPG的结合能力减弱，因而增加了HbF对氧的亲和力。其意义在于胎儿血液流经
胎盘时HbF可以从母体HbA获得O2。 |
发表于 2004-12-23 23:25:35
