基因敲除法

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因为“基因敲除法”具有如此强大的功能，诺贝尔委员会终于把2007年的医学或生理学奖授予了卡佩奇、史密斯和埃文斯三人。这是21世纪该奖第三次授予一项工具性的研究。2003年是核磁共振，2006年是RNA干扰。和“基因敲除”类似，RNA干扰也能作为研究基因功能的绝佳工具。



50多年前，美国科学家约舒亚·莱德伯格（Joshua Lederberg）发现了基因的“同源重组”（Homologous Recombination）现象，因为这个发现获得了1958年的诺贝尔医学或生理学奖。这一现象说起来很简单，大多数高等生物的细胞内含有两套染色体，一套来自父亲，一套来自母亲。这两套遗传系统绝大部分都是一样的，只在少数几个地方有所不同。莱德伯格发现，来自父亲的某段染色体会和来自母亲的对应片断发生互换，这就好比两个双胞胎兄弟互相交换了一只手一样。



“同源重组”是生物界非常普遍的现象，从酵母到哺乳动物都会这么做。广义上讲，“同源重组”是生物体增加变异程度的好方法，在进化上非常有用。从狭义上看，“同源重组”是细胞修复坏基因的办法。比如，来自父亲的A基因坏了，该细胞只要从来自母亲的染色体上把相应的a基因复制下来，通过“同源重组”的办法和坏了的那个A基因交换一下，就可以完成修复。因为A和a非常相似，所以交换过后对该细胞不会有太大的影响。



上世纪80年代初，美国犹他大学的马里奥·卡佩奇（Mario Capecchi）博士突发奇想，觉得“同源重组”可以作为工具，对染色体上的基因加以改造。具体做法是:先用靶细胞的某段DNA作为模板，在实验室里制作一段“同源”的DNA，然后把它导入细胞，诱导细胞的染色体和这段DNA发生“同源重组”。这样一来，外来的DNA就可以准确地整合进细胞的染色体内，代替原来那段基因。



假设科学家在合成“同源”DNA时做点手脚，改变某个关键的顺序，被修改后DNA仍然可以和细胞发生“同源重组”，但整合进细胞中的外源DNA却是坏的，无法正常工作。这样一来，这个基因就被人为地“敲除”（Knockout）了。经过大量试验，卡佩奇证明这个方法是可行，人工引入的DNxxx断确实可以和细胞原有的染色体发生“同源重组”。



几乎与此同时，美国北卡罗莱纳大学的奥利弗·史密斯（Oliver Smithies）博士也在进行类似实验。史密斯的目标是利用基因疗法治疗遗传病，某些遗传性血液病的病因是血红细胞基因变异，史密斯设想利用“同源重组”把正确基因导入到骨髓造血细胞中，修改其错误。如果成功，病人就能依靠被修复的造血细胞生产健康的血红细胞，病就治好了。



史密斯在实验中发现，哺乳动物细胞中的任何一段基因都有可能发生“同源重组”，即使这段基因处于休眠状态也是如此。这个发现意味着，哺乳动物的任何一段基因都有可能被人为地加以修改。



西医最遭人诟病的一条就是缺乏整体观。可是，事实上，现代生物学并不缺乏整体观，只是根据目前的现状，要想进行可控制的整体研究，还有很多困难需要克服。



比如，虽然卡佩奇和史密斯两人找到了“定点改变任意基因”（英文叫Gene Targeting，基因靶向或基因打靶）的方法，但是他俩只能做到改变单个细胞内的基因。要想研究某个基因对于整个生命体的作用，就必须把该个体所有细胞中存在的该基因全部“敲除”，这可就难了。当年卡佩奇曾经向美国国立卫生研究院（NIH）申请研究基金，把这个方法用于哺乳动物，结果被NIH严词拒绝。



但是卡佩奇没有放弃，他偷偷挪用了自己从别的课题申请到的钱，用来资助这项研究，几年后他终于证明这个思路是可行的。与此同时，史密斯也独立地证明了这一点。只不过两人都承认，他们采用的方法效率太低，不大可能有什么实际的用途。



原来，要想把一只小鼠体内某个基因的所有拷贝全部“敲除”，只能从受精卵开始。可是，两人试验了多次都没能提高“同源重组”的效率，做一次这样的试验可能需要成千上万个受精卵，所以当时科学界都认为这个方法在哺乳动物身上是行不通的。



天无绝人之路。正像前文所说的那样，一旦生物学家需要找到某样工具，都会习惯性地把目光转向生命本身，这一次他们又找对了。



同样在上世纪80年代初期，英国卡迪夫大学（Cardiff University）的马丁·埃文斯（Martin Evans）博士偶然发现，小鼠受精卵发育到3.5天时候，会形成一个名叫“囊胚”（Blastocyst，也有人翻译成“胚泡”）的小细胞团，其外层是一圈由扁平细胞组成的“滋养层”，保护着囊胚内的一小团特殊的细胞——“内细胞团”（Inner Cell Mass）。这几十个细胞都是未分化的干细胞，每个细胞都能发育成几乎所有的组织和器官，所以科学家们把这些细胞叫做“胚胎干细胞”（Embryonic Stem Cells）。



埃文斯并不是第一个发现这群细胞的人，但他却是世界上第一个在实验室条件下成功地繁殖胚胎干细胞的人。具体说，他发现，只要模仿“囊胚”中的微环境，在培养皿底部铺上一层不会分裂的细胞作为“滋养层”，就能让培养皿中的干细胞无限繁殖下去，同时又完整地保留干细胞的“全能”特性。于是，埃文斯为“基因靶向”技术提供了足够多的靶细胞。从此，卡佩奇和史密斯博士再也不必担心“同源重组”的效率问题，他俩所要做的只是在人工合成DNA的时候偷偷塞进一个小小的“标记基因”（比如某个抗药性基因），然后把DNA导入培养的干细胞内，进行“同源重组”。这一过程的效率再低也没关系，如果每100万个细胞才能发生一次，那就用100万个干细胞好了，反正细胞有得是。之后，只要把抗生素加进培养皿中，杀死那些没有发生“同源重组”的干细胞，剩下的都是按照科学家的设计而被改变了的干细胞。

只需得到一个“同源重组”干细胞就足够了，剩下来的工作就是把这个细胞进行繁殖，然后重新植入小鼠的囊胚中，再把囊胚植入一只小鼠的子宫里，就能生出一批带有一部分这种特殊细胞的成年小鼠。如果被改变的那个干细胞正巧变成了生殖细胞，就说明这只小鼠的所有精子（或卵子）都被改变了。接下来只要再进行几次选择性的交配，就能生出一批从头到脚所有细胞都被改变了的小鼠。



1989年，卡佩奇和史密斯发表论文，报告了世界上第一只依靠“基因敲除”法得到的小鼠。全世界所有的生物学家们立刻意识到这个方法将给哺乳动物遗传学研究带来一个质的飞跃。



比如，你想研究一下A基因是如何致癌的吗？以前人们只知道这个基因能使B分子水平升高，但小鼠为什么因此而得癌症，谁也说不清。现在好了，只要把A基因“敲除”掉，然后观察没有该基因的小鼠体内发生了哪些变化，哪些分子的水平升高了，哪些细胞受到了影响……就行了。



这个方法让科学家们第一次能够在整体的水平上研究基因的功能。



自那时开始，全世界的实验室一共培养了超过1.1万种“基因敲除小鼠”，也就是说，有超过1.1万种基因被定点地去掉了。这个数字大约相当于哺乳动物整个基因数量的一半。从此以后，如果科学家想研究一下小鼠的某个基因的功能，只要调出这个品系的小鼠，和正常小鼠比较一下就可以了。



目前科学家们正在致力于敲除剩下的一半基因，然后做成一个小鼠基因库，把哺乳动物所有的基因都包括进来。到那时，任何一个基因都可以很方便地进行研究了。



小鼠和人的亲缘很近，很多疾病的病理都是相似的，因此这些“基因敲除小鼠”可以作为人类疾病的“模型动物”，通过研究它们的发病机理，找出治疗方法。



有人也许会问:万一“敲除”掉的是一个对生命十分重要的基因怎么办？小鼠不就活不成了吗？确实，有一部分基因对生命十分关键，是不能缺失的。为此科学家们发明了一种办法，可以让这些基因在小鼠成年之后再失去活性。事实上，目前“基因敲除小鼠”可以有很多种不同类型。比如，科学家可以让基因只在特定的组织内失去活性，或者让一个以上的基因同时失去活性（有些疾病需要两种基因同时失效），甚至可以反其道而行之，人为添加某个基因到小鼠身体里去，从而研究这种基因的功能（这种方法叫做“敲进”〔Knock-in〕）。



总之，任何一种与基因有关的疾病理论上都可以用“基因敲除小鼠”作为模型加以研究，“基因定点敲除”的方法只要稍加改造，就可以用来治疗人类的很多遗传性疾病。



目前，全世界的科学家已经建立了超过500个人类疾病的小鼠模型，从心血管疾病到癌症，应有尽有。有了这些模型，医生们就可以方便地研究这些疾病的病因和治疗方法。“（基因敲除法）彻底改变了生物学研究的面貌。”剑桥大学桑格研究所的所长艾伦·布拉德利（Allan Bradley）在评价“基因敲除法”时说。



值得一提的是，卡佩奇基和史密斯分别出生于意大利和英国，现在都已经加入了美国籍。美国作为全世界生物学研究的中心地位，再一次得到了诺贝尔奖委员会的肯定。另外，21世纪所有的8次诺贝尔医学或生理学奖全部都由多名获奖者分享，显示这一领域的合作达到了前所未有的高度。要知道，该奖在上世纪20年代时候只有2次是多人获奖，到了50年代，多人获奖的情况增加到了4次，从1960开始直到现在，一共48届诺贝尔奖，只有6次是单人独享奖金。



需要指出的是，“基因敲除法”并不是完美无缺的，很多地方有待改进。比如小鼠和人并不完全一样，有时不能照搬从小鼠身上得到的经验。但是，这项研究目前最大的困难在于人们对胚胎干细胞的怀疑态度，这种态度大多出自宗教人士对干细胞伦理的质疑。