荧光定量PCR试剂的工作原理

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用于荧光定量PCR仪的化学染料有多种，包括SYBR Green I、分子 Beacons、水解探针(TaqMan 探针)、ScorpionsTM 探针和AmplifluorTM系统。也可完成实时量化和DNA解链曲线。
SYBR Green I
SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。
分子 Beacons
分子 Beacons是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。由于”黑色” 淬灭剂，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子Beacons的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂由连接于另一端。分子Beacons必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子Beacons的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
分子Beacons不同于SYBR Green的一个优点就是它特异性地检测感兴趣的目标DNA。通过精心设计分子Beacons和优化反应条件（温度和缓冲液）后，其灵敏度非常高，可用于单核苷酸多态性（SNPs）的检测。但是，为检测某一特定的目标DNA，每一个探针都必须单独地仔细地设计。
分子Beacons是美国纽约公共健康研究学会的技术专利。
水解探针(TaqMan 探针)
TaqMan探针是多人拥有的专利技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。
当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶，如DyNAzymeTM II DNA聚合酶（MJ Research公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
ScorpionsTM 探针
ScorpionsTM 探针包括一个扩增引物和一个目标特异性探针，探针部分通过碱基互补形成茎环结构，使得荧光基团与淬灭剂靠近。在扩增过程中，目标序列的延伸通过ScorpionsTM 探针的引物部分来完成。在变性后降温过程中，通过单分子重组，ScorpionsTM 探针的探针部分与扩增产物结合，互补的茎环结构被破坏，使得荧光基团与淬灭剂分离。由于ScorpionsTM 探针是扩增产物的一部分。因此荧光强度与扩增的目标序列数量直接相关。
AmplifluorTM 通用检测系统
Amplifluor系统使用一个通用的引物，只有在引物进入到扩增产物中之后才能发出荧光信号。此引物包含一个18碱基的序列（”Z 序列”），”Z 序列”互补形成发夹结构，在发夹结构上标有荧光基团与淬灭剂。首先，目标序列通过特异性引物进行扩增，其中一个引物的5’端加上了Z序列。在随后的扩增循环中，通用引物与Z序列配对并进行扩增，从而进行扩增产物中。在此过程中，发夹结构的打开，使得荧光基团与淬灭剂分离，因此发射的荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。