口蹄疫转基因植物疫苗研究进展

yujian623

口蹄疫是国际社会广泛关注的严重动物传染病之一，其控制措施主要是疫苗免疫。传统疫苗在该病的防控中起了重要的作用，但是其弊端也不容忽视，研制新型的口蹄疫疫苗是今后的发展方向。近几年来，随着生物技术的发展，可饲疫苗由于其具备的诸多优点而成为国内外研究的热点，口蹄疫转基因植物疫苗的研究在国内外也已经开始，并取得了一定的成果，期望易感动物食用此转基因植物后产生免疫力，达到预防口蹄疫的目的。文章综述了国内外口蹄疫转基因植物疫苗研究的成果。

　关键词：口蹄疫；转基因植物；疫苗

　口蹄疫（Foot-and-mouthdisease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foodandmonthdiseasevirus,FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病，世界动物卫生组织（OIE）将口蹄疫列为动物卫生法典中的A类疫病之首。对该病的防控，我国及第三世界国家主要采用疫苗免疫预防的措施。到目前为止，灭活疫苗仍然是预防免疫的主要用苗，但灭活疫苗存在许多弊端，无论从防疫角度还是从科学研究的角度，都有待于我们开发廉价安全的新型疫苗。

　近些年来，随着植物基因工程的快速发展，植物也被用作生产包括疫苗及药物等一系列蛋白的生物反应器，成为植物基因工程领域内一个研究的生长点。利用转基因植物技术生产疫苗，是将微生物或病毒的抗原基因导入植物，使其在植物中表达，当人或动物摄入这种植物或之中的抗原蛋白后，即可产生对这种抗原的免疫应答。最早用转基因植物表达疫苗抗原的是CutisisRI和CardineauCA，他们在1990年首次报道用烟草表达链球菌变异株（Streptococcusmutans）表面蛋白抗原A（surfaceproteinantigenA,SpaA），并且把转基因的烟草组织饲喂小鼠，结果小鼠产生了对SpaA蛋白的黏膜免疫。1992年，MasonHS等报道将乙肝病毒表面抗原转入植物，随之提出了植物疫苗的概念。到目前为止，人们通过这种技术已经把多种细菌或病毒的抗原基因转入多种植物中进行了表达，有的甚至已经进行临床试验。

　FMDV作为一个重要的病原体，许多国家和地区在进行其生物学及疫苗的研究，而转基因植物疫苗的研制作为一个热点，在近几年备受研究者的重视，本文就口蹄疫植物基因工程疫苗在国内外的研究做一综述。

　1用于转基因植物疫苗的FMDV免疫原基因

　口蹄疫病毒是小RNA病毒科（Picornavirdae）、口蹄疫病毒属?(Aphthovirus)?的惟一成员，其基因组为单股正链RNA，只有一个开放阅读框（Openreadingframe，ORF），ORF由L基因、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因，以及起始密码子和终止密码子组成，其翻译产物为一多聚蛋白，随后该蛋白由病毒编码的各种蛋白酶加工成熟。P1衣壳蛋白由4种结构基因组成，依次为1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)和1D(VP1)[6]。

　到目前为止，用作转基因植物疫苗的免疫原基因主要是FMDV的编码结构蛋白的VP1基因和编码病毒衣壳蛋白的P1基因、非结构蛋白2A、3C所共同组成的免疫原基因。VP1基因编码的蛋白大部分暴露于病毒的衣壳表面，是决定病毒抗原性的主要成分。3C蛋白酶是病毒成熟过程中重要的蛋白酶之一，由它催化多聚蛋白的次级裂解。将FMDVP1基因和3C基因联合在植物中表达，蛋白酶3C可专一性地裂解P1为成熟蛋白，它们装配成的空衣壳可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫。

　2FMDV转基因植物疫苗国外研究现状

　FMDV基因工程疫苗的研制最早开始于1998年，阿根廷一研究小组将FMDVVP1基因转入拟南芥中，给小鼠注射转基因植物提取物，小鼠产生了针对VP1区135位~160位氨基酸残基多肽、结构蛋白VP1和完整病毒粒子的特异性抗体反应，这是首次利用转基因植物表达产物免疫动物产生特异性抗体的试验。1999年，WigdorovitzA等将FMDV结构蛋白基因VP1在苜蓿中有效表达，表达产物口服和注射都产生了免疫反应和保护，从而对利用转基因植物生产疫苗提供了有力的支持。2001年，CarrilloC等将FMDVVP1基因在马铃薯中表达，试图通过构建含有双元启动子表达载体来提高VP1蛋白的表达量，结果表明蛋白表达量与含有一元启动子的表达载体相比，其表达量没有显著的增加。实践证明，到目前为止，转基因植物表达的蛋白量低仍然是制约转基因植物表达系统应用的主要问题之一。现在采用的策略主要是：①病毒基因密码子的优化，根据植物密码子使用的偏好性，将病毒基因作适当的同义突变，从而提高病毒抗原蛋白的表达量；②在翻译起始处加上一段可以提高翻译效率的先导序列；③外源蛋白的靶向表达，目前人们普遍在目的基因的3′端加上一段内质网引导肽SEKDEL，将表达的蛋白定位到内质网中，从而使所表达的蛋白在内质网中累积。尽管如此，要利用植物高效表达外源蛋白，仍然是一个技术难题。

　除了利用VP1基因作为免疫原基因外，近两年来，人们逐渐将目光转移到将FMDV结构蛋白基因作为免疫原基因用于基因工程疫苗的研究上来。FMDV的结构蛋白基因P1在3C蛋白酶的作用下裂解，组装成的空衣壳保留有感染性病毒粒子的免疫原性和抗原性，利用其作为亚单位疫苗的免疫原基因是一种很好的选择。2005年，DusSantosMJ等将FMDV编码结构蛋白的P1基因和编码蛋白酶的3C基因作为免疫原基因导入紫花苜蓿，免疫小鼠产生了特异性抗体并能抵抗强毒的攻击。

　3FMDV转基因植物疫苗国内研究现状

　在国内，FMD转基因植物疫苗的研究起步较晚，但已取得了较大进展。中国农业科学院兰州兽医研究所在国家“863”项目的资助下，较早开展了FMDV转基因植物基因工程疫苗的研究，张永光研究小组将FMDV的结构蛋白基因VP1先后转入牧草百脉根和烟草中，经过多种生物学方法的检测和免疫动物试验，证明取得了较好的效果；潘丽等将O型FMDVP12X?3C基因成功导入番茄和拟南芥中，基因在植物种子中能够特异性表达，将番茄叶片浸出物免疫豚鼠，豚鼠产生了特异性抗体反应，能够抵抗强毒的攻击。孙萌将FMDV的VP1基因导入烟草和衣藻叶绿体中进行重组表达，抗原蛋白含量占可溶性蛋白的2%~3%，比植物核基因组蛋白表达含量有较大的增加，说明在植物细胞器中表达外源基因对提高表达含量有一定的作用,不失为研制FMD转基因植物疫苗的一种好的尝试。

　4存在问题及发展方向

　已有的研究表明，利用植物表达系统生产FMDV疫苗的策略是可行的，但是有许多问题有待解决，如外源基因在植物中的表达量，现有的研究中，外源基因所表达的重组蛋白大约只占植物中可溶性蛋白的0.01%~0.4%，由此产生的免疫剂量问题也不得不考虑，如此低的蛋白含量如何能满足商业化的需要，是实现其产业化的一个难题。如何在植物中精确定量FMDV抗原蛋白含量而为免疫提供指导也比较困难。免疫接种途径也是不得不考虑的一个问题，尽管国内外的试验都尝试用转基因植物免疫动物，但是大多采用的免疫途径是提取植物蛋白浸出物免疫动物，有悖于可饲疫苗的初衷。

　转基因植物工程是综合性的工程，尤其在疫苗研究方面，要想在FMDV转基因植物疫苗上取得实际的应用价值，还有较长的路要走，这不仅需要对分子生物学相关方面的深入研究，而且还要对FMDV的免疫机理，尤其是对黏膜免疫的分子机制有全面地认识。可喜的是，许多科学家都在致力于该方面的研究并且取得了一定的成果，相信在不久的将来，适用的口蹄疫转基因植物疫苗会更贴近于实际应用。