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发表于 2007-12-20 20:53:39
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ELISA 原理与分类
1. ELISA 的原理
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2. ELISA 的类型
ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂 "（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；
（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA 主要有以下几种类型：
2.2.1 双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg、AFP 、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成 "夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg 、AFP 和尿液hCG 等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的a 决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg 的检测中应注意亚型问题，HBs Ag 有adr、adw、ayr 、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的a 决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（ RF）的干扰。RF 是一种自身抗体，多为IgM 型，能和多种动物IgG 的Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有R F，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc 段，从而消除RF 的干扰。双抗体夹心法ELISA 试剂是否受RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2.2.2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
2.2.3 间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig 以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG 检测IgG 抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以 E.Coli 为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli 成份，很可能与受过E.Coli 感染者血甭中的抗E.Coli 抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig 反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig
去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性 IgG 只占总IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
2.2.4 竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA 一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe 的检测一般采用此法。
2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA 测定多用此法。
2.2.6 捕获包被法测抗体
IgM 抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA 一般仅适用于检测总抗体或IgG 抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM 抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG 抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM 抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM 作为二抗，间接测定IgM 抗体，必须先将标本用A 蛋白或抗IgG 抗体处理，以除去IgG 的干扰。在临床检验中测定抗体IgM 时多采用捕获包被法。先用抗人IgM 抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM 抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM 相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM 成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）
抗体的检测模式见图2-7。
类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM 抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG 的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM 和抗弓形虫IgM 抗体已获成功。
2.2.7 ABS-ELISA 法
ABS 为亲和素(avidin) 生物素(biotin) 系统(system) 的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4 个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与 4 个生物素分子结合，因此如把ABS 与ELISA 法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA 系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB 中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA 中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA 应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA 较普通ELISA 多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA 应用不多。
ELISA 质量控制
从1949 年美国College of American Pathologists （简称CAP）首先开始研究临床实验室室内质量控制（简称质控）问题，美国学者Levery 和Jenn ing 于1950 年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉序幕。到70 年代，实验室质量控制进入一个新的阶段--全面质量管理，推行Good Laboratory Parctice
（简称GLP ）。进入80 年代末期，GLP 的统一标准产生了，发展到"认证实验室"管理阶段。
全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学
的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。
本章节主要介绍免疫学检验的统计学室内质控方法。因为ELISA 是目前临床上最常用的一
种免疫学检验方法，就以ELISA 检验为例，介绍一下有关问题。
卫生部临床检验中心免疫质控室从 1988 年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验的质量
评价活动，一直采用这一套质量评价方法，并在实践中不断实践、提高和完善， 希望能找出一条适合中国国情的，行之有效的质量管理的道路。
5.1 基本概念
5.1.1 质量控制（Quaility Control,Q.C）
质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。
1）确定控制的对象；
2）规定控制对象的标准（预期值）；
3）制定或选择控制方法和手段；
4）测量实际数据；
5）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。
6）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。
质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的 "控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的"可追查" 性原因。"可追逆"性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。"控制限"是通过统计计算出来的，在后我们将详细介绍（见5 .3. 室内质控程序）。
5.1.2 误差
实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。
系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和校正的。
随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律。
过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免的。
5.1.3 正态分布及标准差
ELISA 试验中，检验同一样本达20 次以上时，就会发现这组数据（指测定结果的吸光值）分布在均值两侧，大部分集中在均值附近。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为中心对称分布，这就是正态分布。
正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数（X）和标准差（SD）来表示，其计算方法如下：
均值、标准差和概率的关系如下：
X±1SD，概率0.68 X±2SD，概率0.95 X±3SD，概率0.99
换言之，当 ELSIA 检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值（X）的±1SD 范围内的数据，占该组数据的68%，在X±2 SD 范围内分布的数据占总体的95%，在X±3SD 范围内分布的数据占总体的99%。当我们要求检验结果在X±2SD 范围内为合格时，将有95%的数据可能合格。
5.1.4 真值
用确切的、最理想的决定性方法测得的值，称为真值。真值一般是测不到的。通过可靠的决定性方法测出的值，称为靶值，通常用靶值来表示真值的大小。
5.1.5 准确度（accuracy）
是指测定结果与真值（或靶值）接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确度来衡量。测定结果与靶值的偏离程度称为偏差，它表示该项检验的不准确度。
绝对偏差=检验的均值-真值（或靶值）
相对偏差=绝对偏差真值÷（或靶值）×100%
5.1.6 精密度（Precision）
是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间
的符合程度。
5.1.7 标准品
1、国际标准品由WHO 或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。
2、国际生物学活性标准品根据生物学反应由WHO 或相应组织标定的国际活性单位的材料。
3、参考标准血清国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。
5.1.8 临床决定性水平（clinical decision leuel）
当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度称为临床决定性水平。
5.2 质量控制血清
质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。
5.2.1 质控血清的使用
卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在 -20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5 天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6 个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。
5.2.2 临界值质控血清
质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。
5.2.3 质控血清的制备
每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。
1）收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。
2） 56℃加热10 小时来灭活。
3） 离心或过滤除去沉淀。
4）用10%的小牛血清或正常人血清（PBS 缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如
能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。
5） 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要求，则应加所要求浓度的质控物。
6） 标定含量。20-30 次测定结果删除>±2SD 数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对
比测定。
5.3 室内质量控制程序
临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围，以临床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质控范围。
1） 最佳条件下的测定误差。
2） 已知值的血清在常规检验条件下的误差。
3） 未知值的血清在常规检验条件下的误差。
4） 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。
5.3.1 最佳条件下已知值质控血清变异（optimal conditions variance, 简称OCV）的测定
在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20-30 次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的最佳工作质量。
现举例说明HBsAg ELISA 法检测时OCV 的测定。使用的质控制血清为临界血清，HBsAg 浓度为5ng/ml。在该实验室中选择素质最好、操作最熟练的技术员进行认真地专门测定，选用最佳的试剂盒，检测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用新的加样吸头等，即在最佳、最理想的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定，得出2 个吸光值（A 值），求出X。连续作20 次，求出20 个X，即X1……X20。从这20 个数据中，求出OCV 的X 和SD。
5.3.2 常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value, 简称RCVK ）的测定。
做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行 20 次检验，结果计算同OCV 法。一般认为RCV 的SD 在OCV 的SD 两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV 的 SD 值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCVK 的测定。如果RCVK 的S D 值更小，说明OCV 不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV。
常规条件下，RCVK 肯定要比OCV 大。通过质控控制各项条件，使RCVK 的数据尽可能接近OCV 值。RCVK 的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发出。
5.3.3 常规条件下,未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简称RCVU) 的测定
有时为了避免主观性,再作RCVU 测定。测定步骤同 RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。
5.3.4 质控图
通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据 RCVK 的和SD 作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控图可以连续作下去。
质控血清的S/CO 值低于-2SD 的范围,属"告警"，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。ELISA 试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD 是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD 应作为"告警"， 二次超出2SD 为"失控"。当质控过程中，出现失控时，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原因时，应重复进行OCV 的检验。如果OCV 检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。一般认为：
①一次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5 次连续处于一侧的2SD 之内；④5～7 次连续偏向横轴的一侧，均为失控。第③、④ 种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。
5.3.5 统计学计算方法--"即刻性"质控
以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但 ELISA 有其特殊性，最合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA 项目的检验，而ELSIA 试剂盒效期短，用一批号试剂盒连续常规测20 次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3 次，即可对第3 次检验结果进行质控。" 即刻法"的建立具体计算方法如下：
1)先将测定值从小到大排列
2)计算X 和SD。
3)计算SDI 上限和SDI 下限值。
4)将SDI 上限、SDI 下限值与SDI 值中的数字比较。
当 SDI 上限值和SDI 下限值＜n2SD 时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI 上限和SDI 下限有一值处于n2SD 和n2SD 值之间时，说明该值在2SD~3SD 范围，处于" 告警"状态；当SDI 上限和SDI 下限有一值＞n2SD 时，说明该值已在3SD 范围之外，属"失控"。数值处于"告警"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。
即刻性质控统计方法，适于ELISA 测定的质控。
当检测的数值超过 20 次以后，不必再使用"即刻法"质控统计计算，可以转入常规的质控图的质控。将前20 次的数值求出的和SD 作质控框架图，第2 1 次的数值，依次点入即可。
5.4 室间质量评价（external quality assessment, 简称EQA）
室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。
各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验结果的准确度，不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。
5.4.1 室间质评的方法
1、发质控物进行调查
这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物 ELISA 检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA 的结果不能反映该实验室日常工作水平。
2、派观察员到实验室进行试剂调查
这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组
标本，进行评价。这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决问题，提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样本，避免采用质控物的一些缺点。
如何选择ELISA 试剂？
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。前文（2.2）已述，ELISA 中有三个必要
的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。
完整的ELISA 试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。
3.1 免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（ 2~8℃）干燥的条件下一般可保存6 个月。有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。
3.1.1 固相载体
固相载体在 ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA 中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA 载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA 的产品称为ELISA 板，国际上标准的微量滴定板为8×12 的96 孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8 联孔条或12 联孔条的，放入座架后，大小与标准 ELISA 板相同。ELISA 板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA 检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测
抗体时空白值较大。
良好的 ELISA 板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELIS A 板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA 板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA 板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG 抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8 左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为 ELISA 固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
为比较不同固相在某一 ELISA 测定中的优劣，可应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA 操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大，这种载体就是这一ELISA 测定项目的最合适的固相载体。
在 ELISA 中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm 的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。
ELISA 板孔的吸附面积约为200mm2，小珠均为1000mm2，将近ELISA 板孔的5 倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态，因此珠式ELISA 的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊的洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较差。小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式 ELISA 的标本量一般为100-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为 ELISA 固相载体的。其优点是表面积极大，反应在悬液中进行，其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA 固相载体，反应后用磁铁的吸引进行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。
3.1.2 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被 (coating) 。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG 对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc 段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。
当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法（见2.2.4），试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10 乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质
抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA 抗体时，需用DNA 作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如30W 紫外灯，75cm 照射12 小时），以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA 板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA 试剂一般采用这种包被方式。
3.1.3 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如 HBsAg 可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（ 例如AFP 从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA ，在反应中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV 抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA 中所用包被抗原大多为根据HCV 的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg 、HBe Ag 和HIV 抗原等均在ELISA 中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。
3.1.4 包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于 ELISA ，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex 凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG 已可用于包被，高度纯化的IgG 性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH 等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2 的磷酸盐缓冲液及pH7~8 的Tris-HCL 缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA 板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃ 中保温2 小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-2 0ug/ml。
3.1.6 封闭
封闭 (blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5% 的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
封闭是否必要，取决于 ELISA 的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的（见2.2.2）。包被好的E LISA 板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。
3.2 结合物
结合物即酶标记的抗体（或抗原），是 ELISA 中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物尚要有良好的稳定性。
3.2.1 酶
用于 ELISA 的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。
在ELISA 中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA 试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产 ELISA 试剂一般都用HRP 制备结合物。HRP 是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000， 是一种复合酶，由主酶（ 酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm 波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm 波长处有最高吸收峰。HRP 的纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数）表示，是403nm 的吸光度与280nm 吸光度之比，高纯度的HRP 的RZ≥?.0 。
HRP 除符合上述的ELISA 中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ 外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。
国外很多 ELISA 试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的AP 有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的AP 分子量为80000，酶作用的最适合pH 为8.0；用小牛肠膜中提取的AP 分子量为10 0000 ，最适pH 为9.6。在ELISA 中，AP 系统的敏感度一般高于HRP 系统，空白值也较低，但AP 价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP 低。
3.2.2 抗原和抗体
制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的 IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。如用F(ab')2 进行标记，则更可避免标本中RF 的干扰。在ELISA 中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。
3.2.3 结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA 中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1 的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。
2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP 分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff 氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1 。此法简便有效，一般认为是HRP 最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响 ELISA 中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。
结合物制得后，在用作 ELISA 试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG 制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000 稀释后，在与人IgG 包被的固相作ELISA 试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA 检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
3.2.4 结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的 ELISA 试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5 ）临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA 试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6 个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP 结合物加硫柳泵，AP 结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
3.2.5 结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如 1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20， 0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
3.3 酶的底物
3.3.1 HRP 的底物
HRP 催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2 为供氧体，H2O2 为受氢体。在ELISA 中，DH2 一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O- phenylenediamine, OPD) 、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB) 和ABTS[2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)] 。
OPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm 处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP 结合物最常用的底物。OPD 本身难溶于水，OPD•2HCL 为水溶性。曾有报道OPD 有致异变性，操作时应予注意。OPD 见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD 和H 2O2 一般分成二组分，OPD 可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA 试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2 的应用液,只需加入OPD 后即可作为底物应用液。
TMB 经HRP 作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2 溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB 又有无致癌性等优点，因此在ELISA 中应用日趋广泛。酶反应用HCL 或H 2SO4 终止后，TMB 产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。
ABTS 虽不如OPD 和TMB 敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
另一种HRP 的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA] ，经HRP 作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA 的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP 对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide) 。H2O2 应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2 方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定1 年。
3.3.2 AP 的底物
AP 为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP) 作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm 波长处有吸收峰。用Na OH 终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP 也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
3.4 洗涤液
在板式ELISA 中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
3.5 酶反应终止液
常用的HRP 反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA 中一般采用2mol/L。
3.6 阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品(positive control) 和阴性对照品(negative control) 是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA 模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma) 为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg 检测的阴性对照品中不可含HBsAg ，最好抗HBs 也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg 的ELISA 试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
3.7 参考标准品
定量测定的 ELISA 试剂盒（例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5 个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。 |
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发表于 2007-12-20 20:52:35