单克隆抗体的标记

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目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。
. q# Y5 o. J5 K\" b1. 酶标记 x+ q! A U3 _ T; ~3 n4 x
（1） 辣根过氧化物酶（HRP）标记/ j: Q0 U. a# Z/ M( L$ @1 R
　　辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。
% [% ?1 m7 R- _, z程序一：2 h\" A1 I6 T7 J* y b
A. 将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
& c$ d- r- ?1 ]/ yB. 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
+ r0 i, U' Q7 JC. 加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。
8 r2 ~! D3 s5 g RD. 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。
8 c: A! I\" z/ e; R: V4 bE. ?用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。
b) r' x+ @ E0 n, A ]F. 将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。
3 t$ ?& H3 E D0 QG. 酶结合物质量鉴定：
* D$ p2 X$ Z( w# s, _ `5 L+ p　　克分子比值测定
1 Y6 d! K% t! b- p2 {- C; y　　酶量（mg/ml）=OD403×0.4% V& G5 |2 d8 Q) m2 v* q
　　IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62* l6 c8 L) B# |0 ?
　　克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
5 m, k8 R. F4 c& v　　标记率=OD403/OD280
7 i' `+ k\" J: h8 _- ?0 i　　酶活性和抗体活性的测定 可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。$ s! `# u Q5 b2 w T
H. HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。
' N2 ]\" Z8 y! U! X4 ^* y% i程序二：
) f7 {! I/ m9 z\" d/ X4 qA. 将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。
* M1 [( C# o9 aB. 再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。
6 a% V# y+ \\1 f7 hC. 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。- v- Y+ Q3 c4 D2 @ `/ J @
D. 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小时。
3 r4 B4 @7 w% C/ X7 U, c# ME. 再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。/ r6 z7 z1 k; G; i3 q* R- M7 o t
F. 用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。
: L$ U% J. l& O' NG. 步骤同程序一。* `1 T; {# o2 x7 K& m5 M; \\
（2） 碱性磷酸酶（AP）标记$ y1 ~7 Z+ d: Q/ Q8 g
　　碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：* k* R, a7 f V5 N
A. 将5mg AP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时，换液三次。
9 p$ K4 ^ y$ I& i- wB. 加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次
4 V, d9 Q r& S6 p& iC. 换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。' h9 M( H m8 D: Q( Z/ ^
D. 取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。, r1 ^: w& Q$ r2 ~( N8 @
E. 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。
5 `; t+ M& P P8 U& g（3） PAP、APAAP的制备
& G- t1 z3 Q, S# O- C　　PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。- m5 F% {' H\" ^; ]2 t
根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。
8 B2 P% K: q$ |, R\" B+ C& N2. 荧光素标记
; g% D' X( f% z8 i( j（1） 异硫氰酸荧光素（FITC）标记
; L) M\" J2 {9 F- g2 V　　FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下：
% x: o$ X& F\" @\" L$ {& ~A. 以碳酸盐缓冲液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸馏水1000ml）调整抗体浓度至10mg/ml。
2 C; M! C: e4 UB. 取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。
4 [( {% W- n- n6 i S( }; {% i( [C. 称取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅；其后室温避光作用2小时。
) N2 z# m* [' K& `D. 将交联物经Sephadex G25或G50柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为标记的抗体。
\" j3 t' s8 M9 f, X8 u0 I2 ~E. FITC的结合物质量鉴定
, Y% D) G/ ]( p- l* Z. y& r' a　　IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4- I9 q1 k/ Y# P; F+ ?. X- q) ?2 e
　　F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般说，FITC对抗体的摩尔比为3：1时适合于组织切片染色，为5-6：1时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。, Q$ R$ f5 n( W& P+ u- k0 m
F. 标记抗体的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。
% L- W1 {, s# _3 p( y* c1 W5 \\（2） 异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记:# e7 w7 t# W( n) b1 A5 C
基本与FITC标记相同。
\\3 g! `$ l3 V3. 同位素标记
: G4 @& T0 z8 B9 B# }　　必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。4 A4 A4 a& L# U) j
（1） 碘标记
; U- b, h4 w1 M9 R　　用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I衰变产生低能的γ和Χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。最常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I转化成I2，游离I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作步骤如下：( y5 B1 _% t9 S8 V: e) \\
A. 在进行标记之前，先选用截流分子量为20000-50000的凝胶，制备1ml凝胶柱，然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体，封住柱下口，备用。0 O8 G( |' H% z5 Z7 T
B. 加入10ug纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸钠（PH7.5）的1.5ml指形管内。随后，加入500uCi Na125I混匀。
6 Q, C/ W/ B4 H1 _7 v7 HC. 加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。
! l) T) {- i) D/ y$ K' j0 W' OD. 将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml指形管收集。当碘标记物全部进入柱体，加入0.3ml含0.03%叠氮钠的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在第二至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。0 X* y* g! a# I: K h8 B4 k. p
E. 将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。
5 p! y& j; }+ c! i9 z& y9 l4 `/ V. @（2） 生物合成法标记. n8 R! F5 ]* B; {) s
     将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是：) ?+ A' a7 G( ^$ I
A. 离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需2×106个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。
! q% Z) m% s8 j7 DB. 用含2% PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml，加入35S甲硫氨酸（每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗体）。
\" @) B8 w I- }/ @. w5 Y j. S/ E2 C; IC. 经C02培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20体积的1mol/L Tris（PH8.0）及叠氮钠至浓度0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。
. f/ w. }+ b5 N+ K( n. ~4. 生物素标记
, _# O( M |5 `- ~5 k( D/ G    生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是：1 A3 N8 I& A5 H/ _7 m2 x\" x
A. 用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯）。) E\" F5 f7 e3 ~
B. 用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，PH8.0）稀释单抗溶液至1-3mg/ml。+ @7 x( m1 L' z/ O\" P# S. E\" D. m1 a
C. 每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。: T$ g( w3 m; [\" V- \\
D. 按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应，室温放置10分钟9 Z) M1 a7 ?1 `