粗多糖测定方法的研究

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由十个以上单糖通过糖苷键连接而成的碳水化合物称为“多糖”。它一般都是天然高分子化合物。多糖包括活性多糖和膳食纤维两大类。活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和壳聚糖等。这些多糖具有复杂的、多方面的生理活性和功能，如：免疫调节功能；抗肿瘤作用；延缓衰老作用；降血脂、抗血栓作用等功能[1-2]，因而越来越引起人们的关注。

多糖的测定方法目前还没有国家规定的方法,文献报道的方法基本上是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，在作标准曲线大部分都是用葡萄糖来做标准品，而不是用葡聚糖（MW500，000），因为葡聚糖标准品在国内难于获得且价格昂贵。但是根据国内外大量研究资料表明：香菇、金针菇、云芝、冬草、夏草、灵芝、茯苓、猪苓中所含的具有增强免疫、抑制肿瘤、镇静、强心、消炎等生理活性的水溶性多糖均由β(1—3)或β(1—6)糖苷键连接葡聚糖构成主链和支链，有的甚至就是β-葡聚糖，那么用葡萄糖作标准品和用葡聚糖作标准品去测食品中的多糖含量时是否有差别且差别为多少，本文以枸杞多糖和灵芝多糖来进行上述实验。

1.材料与方法

1.1供试材料
枸杞多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60﹪,其含量由国家检测部门检测)；
灵芝多糖 由深圳思味特科技有限公司提供(多糖含量在40-60﹪,其含量由国家检测部门检测)；
葡聚糖（MW500，000） sigma公司；
1.2试剂
（1）铜储备液：
称取0.3gCuSO45H2O,3g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至100ml，混匀，备用。
（2）铜试剂溶液：
取铜储备液50ml，加水50ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。
（3）洗涤剂：
取水50ml,加入10ml铜试剂溶液，10ml氢氧化钠溶液，混匀。
（4）乙醇溶液(80﹪)：20ml水中加入无水乙醇80ml，混匀。
（5）氢氧化钠溶液(10﹪)：
称取lOg氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml，加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。
（6）硫酸溶液：
取10ml浓硫酸加入到80ml左右水中，混匀，冷却后稀释至100ml。
（7）苯酚溶液（5﹪）：
取苯酚100g，油浴蒸馏，收集180℃-182℃馏分。称取精制苯酚5.0g，加入溶解并稀释至100ml，混匀，溶液置冰箱中可保存一个月。
（8）葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液：
精密称取在1050C于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖标准品1.0080g，加水溶解，并定容至100ml，混匀，置冰箱中保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。
（9）葡萄糖/葡聚糖标准使用溶液：
吸取葡萄糖/葡聚糖标准储备溶液2.00ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。

1.3仪器

752C紫外分光光度计
离心机
旋转混匀器

1.4实验方法

1.4.1 葡萄糖标准曲线制备
精密吸取葡萄糖标准使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相当于葡萄糖0，0.04032，0.08064，0.12096，0.16128，0.2016mg）分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液2.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。具体结果见表1。
表1 葡萄糖标准与浓度的关系
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标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度(A) 0 0.166 0.343 0.514 0.690 0.882
___________________________________________________________________
以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线（图1）。

图1 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.4122X-0.0147,相关系数r=0.9996。

1.4.2 葡聚糖标准曲线制备

精密吸取葡聚糖标准使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相当于葡聚糖0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10mg）分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液2.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。具体结果见表2。

表2 葡聚糖标准与浓度的关系
______________________________________________________________________
标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
吸光度(A) 0 0.083 0.171 0.256 0.352 0.456
__________________________________________________________________
以葡聚糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。

图2 标准回归曲线方程图
其回归方程Y=4.635X-0.0145,相关系数r=0.9983。

1.5样品的测定

1.5.1样品提取

称取混合均匀的含粗多糖样品(M)2.0g,置于100ml(V1)容量瓶中,加水80ml左右,于沸水浴上加热2h,冷却至室温后补加水至刻度,混匀,过滤,滤液供沉淀多糖。

1.5.2沉淀粗多糖
精密取1.5.1项下滤液4.0ml(V2)(作四组平行实验)或液体样品(V2)4.0ml(即被测多糖就是液体而不是固体样品)置于50ml离心管中,加入无水乙醇16ml,混匀后,以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用乙醇溶液数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复3-4次操作。接下来沉淀用水溶解并定容至5.0ml(V3),混匀后,供沉淀葡聚糖。

1.5.3沉淀葡聚糖
精密取1.5.2项溶液2ml(V4)置于20ml离心管中,加入NaOH溶液2.0ml,铜试剂溶液2.0ml,沸水浴中煮沸3min,冷却后以4000rpm离心15min,弃去上清液。沉淀用洗涤剂数毫升洗涤,离心后弃去上清液,反复3次操作后,沉淀用硫酸溶液2.0ml溶解并转移至50ml(V5)容量瓶中，加水稀薄至刻度，混匀。此溶液为样品测定液。

1.5.4 测定
精密取1.5.3项的样品测定液2.0ml(V6)置于25ml比色管中，加入苯酚溶液2.0ml,在旋转混合器上混匀后,小心加入浓硫酸10.0ml后于旋转混合器上混匀后,置于水浴中煮沸10min,冷却至室温用分光光度计在490nm波长处,以试剂空白为参比,1cm比色皿测定吸光度值，同时做样品空白实验。从葡萄糖/葡聚糖标准曲线上查出葡萄糖/葡聚糖质量,再计算样品中粗多糖含量(见表3)。

表3.以葡萄糖计和以葡聚糖计来确定粗多糖含量
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编号 吸光度 样品中枸杞多糖含量(mg/g) 样品中灵芝多糖含量(mg/g)
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枸杞多糖 灵芝多糖 以葡萄糖计 以葡聚糖计 以葡萄糖计 以葡聚糖计
1 0.150 0.146 0.453 0.431 0.423 0.403
2 0.145 0.148 0.440 0.417 0.429 0.408
3 0.139 0.142 0.423 0.402 0.413 0.394
4 0.150 0.151 0.453 0.431 0.437 0.416
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2.计算公式
W1-W2)×V1×W3×W5/M×V2×V4×V6
式中: X-----样品中粗多糖含量(以葡萄糖/葡聚糖计),mg/g
W1----样品测定液中葡萄糖/葡聚糖质量,mg
W2--- 样品空白液中葡萄糖/葡聚糖质量,mg
M----样品质量，g
V1----样品提取液总体积,ml
V2---沉淀粗多糖所用样品提取液体积,ml
V3----粗多糖溶液体积,ml
V4---沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积,ml
V5---样品测定液总体积,ml
V6---测定用样品测定溶液体积，ml

3.稳定性试验

样品显色后,每隔一定时间测定吸光度,结果见表4。

表4 吸光度稳定性试验
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时间 10min 20min 30min 1h 1.5h 2h
A 0.150 0.151 0.148 0.151 0.150 0.147
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结果表明，该显色反应稳定。

4．回收率测定（采用加样回收法）

吸取多糖样品溶液0.5ml，分别加入标准葡萄糖溶液0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml，分别置于25ml试管中，各加水1ml,加入苯酚溶液2ml，缓缓加浓硫酸10ml于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。结果显示回收率是93.15-99.7﹪。

5.小结

(1)由表3可知,用葡萄糖来做标准品和用葡聚糖做标准品测食品中的粗多糖含量时,前者测的结果稍偏高,大约高4.8﹪,但葡聚糖标准品的价格昂贵且在国内难于买到,故可以用葡萄糖来代替葡聚糖做标准品。
(2)食品中分子量>10000的高分子物质在80﹪乙醇溶液中沉淀，与水溶性单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性的从其它高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，粗多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定样品在粗多糖含量。
(3)此方法可很好的用于食品中粗多糖含量的测定，因为不需要对多糖进行纯化和脱色处理。
(4)洗涤粗多糖沉淀时，一定要将离心管壁上玷污的其它糖分和碳水化合物用80％乙醇洗净，否则结果会受影响。