|
|
建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术(Gene targeting)是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段[1-3]。通过对生物遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，疾病发生的分子机制，提供相关的疾病治疗药物、评价模型及新型预防、治疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段。本文概述基因打靶的背景、原理、策略、生物学应用及问题与展望。
一、基因打靶研究的背景
目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现：①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺如；②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；③外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；④导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。
二、基因打靶原理
生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNxxx段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。早在20世纪初，Morgan等人通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的DNA重组是产生交换的基础。1985年在哺乳动物细胞中实现了同源重组[4]。基因打靶通常是指用含已知序列的DNxxx段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术[5]。
ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。自从1981年美国的Gail[6]和英国的Evans等 [7]分别成功地从发育中的小鼠囊胚的内细胞团（inner cell mass）分离出胚胎干细胞, 随后, 又从原始生殖细胞——一种最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中得到具有胚胎干细胞相似特性的细胞群，称为胚胎种系(embryonic germ，EG)细胞[8]。胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的一系列成体组织[9]；正是由于胚胎干细胞的特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1984年， Bradly等[10]成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的动物模型[11]。此后，这项技术得到了普遍应用和长足发展。
三、打靶载体的构建
基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。
基因打靶载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基因置换型载体(Gene—replacement vector)。插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。
四、外源DNA导人的方式
外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注射法。Capecchi报道，用显微注射法导入可得到很高的转染效率，占接受外源DNA细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES细胞稳定转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力[12]。
五、基因打靶的筛选方法
（1）正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)
为了更好地筛选发生同源重组的克隆，1988年Mansour[13]等人设计了PNS, 解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和 GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因 Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。除了上述方法外，还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞。
常用的选择标记基因：正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶（neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）、SacB、 rpsl（strA）、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB等[14]。
（2）正相选择法（positive selection method）
麻省理工学院Sharp教授的研究组独辟新径，建立了一种新的同源重组选择方法—正相选择法[15]。这种选择法适用于在靶细胞内正常表达的基因的定点突变。其主要程序是：将选择标记基因 neor的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染进靶细胞，可能出现下面几种情况：①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失；②外源打靶序列随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻；③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达；④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。
利用正相选择法，Sharp等对NIH/3T3细胞转化而来的MT-1.4细胞系中的癌基因pmt成功地进行了定点突变。之后不久，哥伦比亚大学的 Schwartzberg等[16]用此方法也实现了另一种细胞癌基因c-abl在 ES细胞中的定点突变。最近，利用与正向选择法相似的原理，Jasin等[17]对小鼠T淋巴细胞系CD4位点亦成功地进行了定点突变。
六、基因打靶的策略
（一） 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略
在ES细胞中进行基因打靶最常用的策略依然是使用PNS载体[13]。借助于阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键的外显子中[18，19]，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能域[20]，实行靶基因的完全剔除。阳性选择标记基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），将其以正确的读框插入靶基因的外显子中，除了剔除靶基因外，通过分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表达的时空顺序。 lacZ基因5’端若携带内源核糖体插入位点(internal ribosomal entry sites，IREs)，则lacZ基因的插入会不受时相的控制而得到正确的翻译[21]。
此外，由于阴性选择基因(多为tk基因)可能在转染及整合过程中失活，导致打靶载体随机整合的ES克隆得以生长，因而PNS载体依然得到较多随机整合的 ES克隆。为了提高中靶细胞筛选的效率，常采用启动子缺失的打靶载体[22]。载体中阳性选择标记基因neo是不带启动子的，只有发生正确的同源重组， neo基因被精确地插入靶基因启动子后，抗性基因才会表达，并使ES克隆在选择性药物培养基中存活下来。若在neo基因5’端连接上IREs位点，则可以在任意外显子中插入而起相同的作用。
（二） 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping)
用常规方法进行基因打靶，必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，需耗费大量的时间和人力。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的 ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析[23]。典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因。neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含 G418的选择培养基中筛选出来。从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。
用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。但此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。随着应用哺乳动物体细胞克隆新个体的成功实现[24，25]。在体细胞中应用基因捕获剔除更多在发育晚期才表达的基因，其后通过核移植技术获得带有突变基因的动物个体、这不失为一种可以弥补以上缺陷的办法。此外用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。
（三）精细突变的引入
人类疾病中许多是由于基因功能丧失引起的，也有许多是由于基因过表达或功能获得（gain of function）引起的。对后者就无法用基因剔除的方法获得相应的疾病模型。为此，研究者发明了各种可以将诸如插入终止密码子或替换某个氨基酸之类的精细突变引入小鼠基因组中的方法。早期的研究者采用的方法主要有两种，一是将不含选择标记基因的打靶载体直接经显微注射法引入ES细胞，然后用PCR分析鉴定同源重组克隆[26]；另一种是用带有精细突变但无选择标记基因的打靶载体与仅含标记基因的载体经电穿孔共转染ES细胞[27]。这两种方法在技术上有很大局限性，现在基本上已不再使用。目前较为常用的方法主要有“Hit and Run”、“Tag and Exchange”以及基于重组酶系统的方法[28]。
（1）打了就走策略 (Hit and Run 法)
Hit and Run法，也称进退策略。这一方法包括两次同源重组：第一步（Hit）用插入型载体进行同源重组，这样会在靶位点插入带有突变的基因组序列以及载体骨架，载体骨架上带有两个筛选标记（如正筛选标记基因neo和负筛选标记基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性筛选，富集为数不多的发生了染色体内重组的克隆。染色体内重组去除了含有负筛选标记基因的载体序列，由于负筛选标记基因的消失，细胞就恢复了对负筛选药物的抗性，因此，回复突变体可以在负选择培养基中存活下来。为了便于应用Southern方法对中靶克隆进行筛选，可对靶基因突变位点的相邻核苷酸进行改造，产生一个新的限制性内切酶位点而不影响相邻氨基酸的组成。有时可以通过改变碱基组成使突变基因序列和野生型基因序列间的差异达到最大，以便于用不同的PCR引物检出突变基因和野生型基因。 Hasty等[28]用此方法在小鼠ES细胞同源异型基因簇Hox-2.6基因3’ 端引入了一个终止密码子，得到了减少43个氨基酸的突变蛋白。
Hit and Run法的不足之处是：第一，此过程中第二步染色体内的同源重组无法精确地控制，可能会导致失去携带突变的同源序列，而留在基因组中的仍是未修饰的内源片段。第二，整个过程需要采用两种培养基分别进行先后两次筛选。第三，无法同时引进多个位点突变。另一类采用置换型载体进行基因打靶、将突变经过两次同源重组引入靶基因的策略部分地弥补了这些缺陷。
（2）双置换法 (Double Replacement)
最早提出这一设想的研究者称其为“In-Out”法[29]。第一步用含有Hprt基因的打靶载体转染Hprt– ES细胞，由于Hprt基因双侧是靶基因的同源序列。通过在HAT培养基中筛选并用PCR进行基因组分析，筛选发生同源重组、Hprt 基因整合到基因组中的阳性克隆。第二步，用只携带突变同源序列的打靶载体转染第一步获得的Hprt+ES细胞。同源重组发生后，突变序列整合入基因组， Hprt 被置换出来。Hprt–细胞可在6-GT培养基上筛选并用PCR进行分析。这种方法的优点在于，第一步获得的Hprt+ES细胞，除了可用于产生普通的基因剔除小鼠外，更可作为将不同突变引入靶基因的基础。1995年，Moore[30]等将这种方法稍加改进，称其为“双置换法”（double replacement）。他们用这种方法将5种突变分别引入Prion蛋白基因，探讨研究人类Prion蛋白相关疾病及其基因治疗的可能性。
（3）“标记和置换”法 (Tag and Exchange)
“标记和置换”的策略与双置换法有许多共同之处。它是用两个不同的置换型载体进行两次连续的基因打靶完成的。通过第一步的同源重组插入正负筛选标记基因（如neo和tk）对靶基因进行“标记”。第二步打靶用在同源序列上带有精细突变的载体来转染第一步得到的ES克隆，带有精细突变的同源序列将置换下被 “标记”的靶基因。Askew等[31]用标记和置换法成功地将ES细胞内源的Na+-K+-ATP酶基因改变了两个氨基酸，使其既能维持转膜运输的离子泵功能，又能抵抗强心类糖苷的抑制作用。另有一种类似于“选择与标记”的双置换法，其唯一不同之处在于：第一步所用打靶载体不是单纯的将neo和HSV- tk基因插入靶基因同源序列中，而是在标记基因插入的同时缺失了一段同源序列。Wu等[32]用这种方法将点突变导入内源的胶原蛋白基因Col1a-1, 使得能在体内测试这一突变体能否抵抗胶原酶的酶解作用。
（4） 利用Cre-LoxP系统引入点突变
近年来，导入精细突变最常用的方法应首推以Cre-LoxP为基础的重组系统[5，33]。Cre-LoxP位点特异重组酶是由酵母或细菌所编码、可识别特异靶位点并在其上催化断裂和重接、从而产生精确的DNA重组的一类酶。根据序列相似性，重组酶可分为Int家族（integrase family）和resolvase-invertase family。Cre是来源于P1噬菌体cre基因所编码的一个38ku蛋白，属于Int家族，它可识别P1基因组上由34bp核苷酸序列构成的称为 LoxP的特异靶位点，并根据Loxp的方向性，可在各种底物（超螺旋环状型，松弛型和线型DNA分子）上介导三种不同的重组事件：①相位点之间序列的缺失；②插入序列；③两个反向位点之间序列颠倒。需指出的是，Cre重组酶所催化的是一个可逆的重组事件，重组的程度与重组酶的表达水平相关。此外在位点特异重组反应的任何阶段上，不需要任何辅助因子参与；该特点使Cre/LoxP位点特异重组酶系统成为可在各类种属上进行意向DNA操作的有用工具。 [34，35]
应用Cre-LoxP系统将精细突变导入基因组的策略为：在置换型的打靶载体中，正负筛选标记基因两侧各放置一个LoxP序列，并被置于靶基因的内含子中。携带精细突变的外显子位于载体一侧的同源臂上。经过同源重组和突变的鉴定后（如利用新产生的酶切位点来鉴定），通过转染将Cre重组酶表达质粒导入中靶ES细胞。
近年来，研究者利用Cre-LoxP系统研制了多种携带精细突变的小鼠。糖皮质激素受体（GR）基因剔除导致小鼠在出生时死亡[36]。为了进一步深入研究GR介导糖皮质激素在活体中的功能及其机制，Reichardt等[37]利用Cre-LoxP系统得到了在GR基因的某一个二聚体功能域（dimerization domain）带有点突变的小鼠（GRdim）。GRdim突变小鼠成为研究ER调节生理和病理过程的功能及其机制的良好动物模型。
Huppert等[38]将小鼠Notch1基因的第1744个氨基酸由缬氨酸（GTG）突变为甘氨酸（GGG），该突变位点是蛋白水解酶的消化位点。携带该突变的小鼠与Notch1基因剔除小鼠的表型十分相似，在胚胎期12.5d前死亡。对该小鼠的表型分析结果表明，有效的膜内信号转导过程对于胚胎发育是必需的。
Single等[39]利用
Single 等[39]利用Cre-LoxP系统研制了携带***AR基因N598Q或者N598R点突变的小鼠；Kew等[40]用相似的策略获得了携带***AR 基因点突变D481N和K483Q的突变小鼠。D481N纯合子突变小鼠发育正常，其他3种突变小鼠在出生后不同阶段死亡。对这些小鼠的表型分析证实了 ***A受体及其各个功能域在神经系统发育和功能中的重要作用及其机制。
研究者还通过在小鼠基因组中引入精细突变来研制人类疾病的精确模型。Chen等[41]经一次打靶将fgfr3突变引入小鼠基因组中，获得突变小鼠后再与 EII-Cre转基因小鼠杂交，利用在生殖细胞中表达的Cre重组酶活性删除了fgfr3突变小鼠基因组中的两侧带LoxP序列的选择标记基因，获得了精确模仿人类侏儒症的模型小鼠。随后，采用类似策略将不同突变引入fgfr3基因和fgfr1中，获得了不同程度患有骨骼疾病和侏儒症的模型小鼠[42， 43]。
（四）条件性基因打靶
基因打靶技术尽管克服了经受精卵原核显微注射技术引起的，诸如外源基因随机整合，其拷贝数不能控制的局限性，但由于knockout小鼠的所有细胞基因组上都存在基因的缺失/突变，往往引起严重的发育缺陷或胎儿死亡，不利于在发育后期阶段基因功能的分析。即使发育完整的突变体小鼠，对于knockout表型的解释常遇到两个困难问题：一是所有体细胞基因的剔除，很难将异常的表型归于哪一类细胞或组织，二是很难排除在成熟动物上由于发育缺陷所引起的异常表型。另外，由于广泛应用neo 和HSVtK作为正负选择系统，发生同源重组的细胞基因组中总留有外源的选择标记(neo)基因；该基因可能影响相邻基因的表达，不利于对突变表型的精确分析。以Cre/LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件性基因打靶(conditional gene targeting)将可克服上述的局限性。该策略主要是运用打靶基因置于同向LoxP之内的打靶载体，经在ES细胞上同源重组及筛选，将携带该载体的小鼠与受控于组织特异性启动子或诱导性启动子的Cre基因的TgM交配，经Cre介导重组，即可获得靶基因在某一组织器官或发育时期上缺失的 knockout小鼠。Gu[44]首先应用该策略在TgM体内成功地实现了DNA聚合酶β基因在T细胞上基因打靶。Cre介导的在脑[45]、乳腺 [46]、肠[47]等组织器官的条件性基因打靶小鼠亦相继产生。
因此，条件基因打靶有如下特点：①通过条件性基因敲除，研究完全敲除具有致死效应的基因的功能以及基因在特定的组织细胞或个体发育特定阶段的功能。②通过条件性基因激活，实现转基因的可控制性表达[48]。③③通过Cre切除条件性基因修复(Cre excision-conditional gene repair)，进行基因的可修复性敲除，以研究一个基因的多种功能[49]。
（五）时空特异性基因打靶
完全基因剔除将靶基因自产生时刻起在所有的组织器官中终生灭活。许多在成体器官发育中具有重要功能的基因，如肿瘤抑制基因Brca1、Brca2、 Dpc4/Smad4等，由于在胚胎早期表达，基因剔除后往往导致小鼠胚胎早期死亡，使得研究者无法深人探索这些基因在成体中的重要作用。因此可以在特定的时间和空间—即在特定的发育阶段和特定的组织细胞中开启或关闭特定基因的时空特异性基因打靶（spatiotemporal gene targeting STGT）技术应运而生。
Cre/LoxP和FLP—frt系统[33、50]的应用使得组织特异性基因剔除变为现实。第1例应用Cre/LoxP系统研制成功的组织特异性基因剔除小鼠是由Gu等人[44]在1994年报道的。构建条件剔除（conditional knockout）小鼠的打靶载体，常将阳性选择标记基因置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧的内含子中插入方向相同的LoxP序列，因为许多时候选择标记基因即便被放置在内含子中，也会阻断靶基因的转录[51]。Meyer等人[52]同时应用Cre—LoxP和FLP—frt系统研制了系列fgf8等位基因突变小鼠。fgf8染色体组上的不同区域分别放置了成对的LoxP序列和frt序列，通过与Cre或FLP转基因小鼠杂交可以分别获得完全敲除小鼠和条件敲除小鼠。此外，还可通过感染表达重组酶的腺病毒或逆转录病毒实现组织特异性的重组。
为了达到在时空上调节基因打靶的目的，研究者将Cre基因置于配体或药物可诱导的启动子控制下，Kühn等人[53]在1995年报道了Mx1—Cre转基因鼠的研究，Mxl是一种与抗病毒感染相关的基因，它在健康的小鼠中是不表达的，但可被重组干扰素或干扰素诱导剂pI—PC诱导。另一个常用的系统是四环素调节系统[54]。St-Onge等人[55]证实应用经典的tet系统可实现Cre介导重组的诱导控制，但存在较高的背景Cre重组酶活性.。这些研究都是试图在转录水平上来控制Cre重组酶的表达从而达到在特定时段将靶基因剔除的目的。另一类研究则采用在转录后水平调节重组酶活性的策略。Feil 等人[56]将Cre基因与人雌激素受体突变的配体结合功能域融合，产生的Cre-ERT具有tamoxifen依赖的重组酶活性。他们将融合蛋白置于巨细胞病毒(CMV)的启动子下研制成功了转基因小鼠。第1例对Cre重组酶活性真正实现时空上调节的研究是1998年由Schwenk等人[57]报道的。他们应用B细胞特异的启动子将Cre-ER融合蛋白的表达限制在B淋巴细胞中。B淋巴细胞中Cre介导的重组效率高达80％。
应用Cre-LoxP系统，研究者可以如愿以偿地在不同的时相、不同的空间按预期的设计进行基因剔除。然而，现阶段可利用的组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠还十分有限。对Cre转基因表达的精确控制还依赖于更多组织特异性标志基因的发现以及人工调控基因表达系统的进一步研究。
（六）染色体组大片段的删除和重排
（1） Cre介导的非同源染色体间的重排
基于Cre-LoxP系统的位点特异性重组可以介导长距离的重组，这种重组已被应用于果蝇[58]和植物[59,60]，在哺乳动物中也取得成功 [61]。Li等[62]用此方法成功地将淀粉样前体蛋白基因（APP）200kb的片段去除。其方法为在第一次打靶的过程中同时将两个选择标记基因 neo、tk及3’端缺失的hprt基因和LoxP序列引入到靶位点的上游，通过筛选得到neo抗性的阳性克隆。筛到的克隆用于进行第二次打靶，在靶位点的下游引入另一个LoxP序列和5’端缺失的hprt基因，同时引入两个选择标记基因hyg和tk基因。中靶的阳性克隆在Cre重组酶的存在下发生重组将 tk基因去除，将对FIAU产生抗性。同时，两端部分缺失的hprt基因在染色体上重新组成有功能的hprt基因，使该克隆能在含HAT的培养基中存活 [61]。具体的实施过程有两种策略：一种是通过两次打靶分别将两个LoxP位点引入靶位点。中靶的克隆转染表达Cre酶的质粒，去除两个LoxP位点之间的序列；另一种是第一次中靶的克隆直接转染第二次的打靶载体和Cre酶表达质粒，直接筛选最终中靶的克隆。两种方法都得到了嵌合体小鼠[62]。 Justice[63]等用此系统研制了携带毛色基因标记的染色体组大片段缺失的突变小鼠。此后Zheng[64]等用此系统研制了带24cm倒位突变的小鼠，该小鼠在11号染色体上p53和Wnt3基因之间的倒位突变隐性致死，并带有一个显性标记K14Agouti 毛色转基因。这种倒位具有平衡染色体（balancer chromosome）的功能，这种用毛色基因标记的倒位突变将成为对小鼠染色体组进行功能分析的重要手段。Zhu等[65]用Cre-LoxP系统将位于小鼠11号染色体的一个长约450kb的片段（与人染色体5q31相对应）进行了删除，发现了与甘油三酯正常分泌和代谢相关的新基因OCTN2。
（2） Cre-LoxP介导的姐妹染色体间的重排
哺乳动物细胞中有相当数量的基因是多拷贝的，这些多拷贝的基因在染色体上排列在一起形成基因簇。基因簇中的基因具有相同或相似的功能。用基因打靶的方法研究这些基因的功能必须使这些基因同时产生突变。如果基因簇内的各基因的遗传距离较大，可以分别在每一个拷贝上引入突变，通过子代的杂交获得每个拷贝同时带有突变的个体。但当基因簇内的各基因间的距离很小时，染色体交换的频率非常低，无法通过子代杂交获得各拷贝同时带有突变的个体。用Cre-LoxP系统可以实现这一目的。具体的实施策略是将两个LoxP序列通过同源重组分别引入到两个基因中去，得到两个分别带有LoxP序列的小鼠品系。两个品系杂交，就会得到在两条姐妹染色体上同时带有LoxP序列的小鼠，再和表达Cre酶的第三个小鼠品系杂交便可获得两个拷贝同时删除的子代。Matsuaka等[66] 将编码肾素基因簇内的两个基因ren1和ren2用此方法同时灭活获得了成功。
2007-10-9 10:44 AM 2
资料 个人博客 邮件 消息 编辑 引用 举报该帖
gene121
金虫
金币: 723.5
帖子: 809
流量: 857 MB
注册: 2004-1-8
状态: 离线
性别: GG
专业: 分子生物学
专辑: 点击查看
Cre介导的非同源染色体间的重排
人类的许多遗传疾病是由于染色体的易位引起的，应用Cre-LoxP系统成功地建立了相应的动物模型。其原理是，将LoxP序列分别引入到非同源染色体上，在Cre酶的存在下诱导非同源染色体之间的重组。Van Deursen等[67]通过两次连续的基因打靶将两个LoxP序列分别引入到小鼠ES细胞的13号染色体的DEK和2号染色体的Can基因中，两次中靶 ES细胞转染超螺旋结构的编码Cre重组酶的质粒，得到了染色体易位的ES细胞。
上面提到的几种染色体大片段的删除和重排，需要对染色体靶位点有充分的了解，而对那些背景不太清楚的染色体部位却无能为力。Su等[68]设计了一个反转录病毒介导的打靶载体，实现了在ES细胞染色体上特异位点的巢式缺失，克服了这一缺陷。首先在一个特异性位点的一端通过同源重组导入一个含有LoxP序列的5’Hprt框。然后通过重组反转录病毒在ES细胞中随机整合另一个含有LoxP序列的3’Hprt框，5’Hprt和3’Hprt是Hprt基因分别去除3’端和5’端的产物，单个的部分基因没有功能，两个部分互补，重组后能形成一个具有功能的Hprt微小基因。在Cre酶的作用下，两个LoxP序列之间的基因组序列被重组掉，重组后形成Hprt微小基因，使重组后的ES细胞在选择培养基中存活下来。这样可实现针对特定靶位点的巢式缺失。此策略基于 Cre-LoxP重组系统的两个特点：一是Cre酶介导的重组效率在一定的范围内不受两个LoxP位点之间距离的影响[69,70]，其距离可以是几个 kb,也可以是几个Mb，但不适于小的片段。二是位于同一条染色体的两个LoxP位点之间序列重组的效率比分别位于两条同源染色体的重组效率高3倍 [61]，而位于非同源染色体上的两个LoxP 位点间的重组效率更低。这种大片段染色体的巢式删除为染色体功能图谱的制作提供了一个很好的技术手段。
（七）诱导性基因打靶
（1）诱导性基因打靶原理
它主要由Cre/loxP及诱导系统组成。Cre／loxP系统由重组酶Cre和该酶的特定作用位点loxP组成，其中的重组酶Cre可诱导LoxP所在的DNA发生缺失、插入、重复、倒位和易位等多种形式的基因突变或染色体畸变。诱导性基因打靶就是以该系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制、或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。
（2）诱导性基因打靶的类型
根据所用诱导剂的种类，诱导性基因打靶可分为四环素诱导型、干扰素诱导型（二者所用诱导剂为控制Cre基因表达的启动子活性的活化物)和激素诱导型(所用诱导剂为Cre酶活性的激活物)等几种类型。而对由病毒或配体／DNA等载体介导的Cre定位表达系统来说，如果其Cre基因的表达或其目的产物Cre酶活性并不需要诱导剂的存在，那么严格说来它并不属于诱导性基因打靶的范畴。反之，则不失为一种不错的诱导性基因打靶策略，并且它因为不用建立Cre的表达或Cre的酶活性具有可诱导特性的转基因动物而可使成本降低。
总之，以Cre／loxP系统介导的位点特异性重组为基础的诱导性基因打靶术的确有其优势：①诱导基因突变的时间可人为控制；②可避免因基因突变而致死胎的问题；③在2个loxP位点之间的重组率较高；④如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。如果在Cre-ERT和Ad-Cre表达系统中采用组织细胞特异的启动子来控制Cre的表达，其诱导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高。
（八）基因敲入（Gene Knockin）
通过基因打靶，用一种基因替换另一种基因以便在体内测定它们是否具有相同功能。也可通过该技术进行靶向基因治疗。与基因敲除不同之处在于：设计载体时将靶基因第一外显子N端缺失并将新的替换基因置于靶基因的调控序列之下。
七、基因打靶的影响因素
基因打靶的效率是指可检测到的细胞中发生同源重组的细胞数与转染的细胞总数之比，又称同源重组效率。基因打靶效率在不同的研究报道中变动范围较大，其波动性来自较多的影响因素。
(1) 打靶载体的影响
打靶载体中同源序列是决定同源重组效率的关键因素，Thomas和Capecchi[71]研究表明，当载体同源序列长度从4kb增加至9kb时，基因打靶效率增加10倍，与此同时，非同源重组效率增加40倍。Zimmer等[72]用显微注射法将含20kb同源重组序列的载体插入小鼠基因组，破坏了 Hox1.1基因，其效率是1/150。Hasty等[11]研究发现，同源序列达一定长度后，继续的增加对同源重组效率不产生显著影响。另外，载体上的非同源序列对打靶效率可能产生影响，片段插入的数目和位点可能与同源重组效率有关，但不是主要的影响因素。
(2) 外源DNA导入方式的影响
目前，外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒感染法。不同的导入方法对同源重组效率有明显影响。目前应用最广的是显微注射法，用显微注射法导入可得到很高的转染率，占接受外源DNA细胞的10~20%，但显微注射每次只能注射一个细胞，而用电穿孔法可同时使许多细胞得到转染，可使1%的ES细胞稳定转染。小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的建立，为基因打靶提供了受体细胞，ES细胞传代稳定，体外可操作性强，可在体外培养的水平上进行转基因整合的筛选鉴定，达到定点整合的效果，对制作转基因小鼠和研究转基因的结构和功能起到了巨大的推动作用。然而，至今世界上尚未建立起牛、羊、猪等大动物的胚胎干细胞系，这成了阻碍ES细胞法发展的主要障碍。1993年，Squires等利用精子载体法制作转基因鸡，其阳性率为 15~25%。近年，精子载体法研究在不断的进行，影响DNA与精子结合的因素可能是获得成功的一个关键因素。而逆转录病毒载体法利用某些病毒对某些组织具有特异的亲合力，在人类疾病的基因治疗方面显示了良好的发展潜力。
(3) 靶基因的影响
早期研究缺陷型标记基因时发现[78]整合标记基因的同源重组效率与它在基因组中的插入位置有关，说明基因组中的不同区域对同源重组过程产生了影响。 Thomas[73]和Doetschman[74]等在小鼠ES细胞Hprt基因的定点突变中，以基因顺序的不同部分作为目的突变区域，结果发现同源重组效率有明显差异，说明基因结构顺序对同源重组效率有影响，一般认为，转录活性基因有利于同源重组，靶基因拷贝数的增加并不能提高同源重组效率。
(4) 调控元件的影响
目前，转基因的整合具有位置效应已被公认，由于受整合位点周围染色质翼区的影响，因而在许多情况下影响到表达水平和组织特异性表达，5’端的启动子和增强子，3’端终止子都对转基因的整合产生作用，这也是某些打靶载体选择组织特异性启动子的原因。外源转基因的有效表达还取决于其是否有内含子，因为内含子中存在的转录调控元件可影响mRNA的剪接和启动子于内含子间的调节反应，另外，内含子可能含有能开放染色体功能域的一些序列，也可能通过影响核质成分、位置等来提高转基因表达。
此外，目的基因插入片段大小、载体DNA是否线形化等也影响基因打靶的效率。
八、基因打靶技术的应用前景和展望
(1) 基因功能的研究
后基因组时代主要任务就是研究***大量新基因的功能。用体细胞基因打靶技术通过定点改造基因组中的特定基因，有可能在细胞水平上研究某一基因的功能及调控机制；从定点突变的干细胞获得基因突变型个体，可在生物体整体水平上了解某些基因在体内的具体作用。另外，胚胎发育是非常复杂的生命现象，在这一过程中包含着许多生理、生化的复杂变化，尤其是要考察某一基因对某一组织器官发育的影响，用传统的研究方法很难进行观察研究。基因打靶为这一领域的研究提供了理想的方法。
(2) 建立人类疾病的动物模型
人类疾病动物模型对病理研究及临床治疗非常重要。自发或诱变病理模型需漫长的时间；应用转基因技术，外源基因在基因组中的随机整合可能带来不确定的表型。基因打靶技术在很大程度上克服了上述不足。通过对ES细胞打靶可获得含特定突变基因的小鼠模型。
(3) 用于疾病的基因治疗
通过基因敲入技术将正常基因引入病变细胞中，取代原来异常的基因或对缺陷基因进行精确改正，使修复后的细胞表达正常蛋自，不再表达错误产物，是一种理想的基因治疗策略。另外，可通过基因敲除技术敲除多余的、过量表达的、影响正常生理功能的基因以达到治疗目的。
(4) 用于改造生物和培育新的生物品种
基因打靶技术的出现使转基因动物和生物反应器的制备更为精确，外源基因将被准确地插入受体的基因组中，定点改造原有的基因功能，使生物获得优良的性状、并避免由于外源基因在基因组中随机整合可能带来的不利影响。对动物生殖细胞或早期胚胎干细胞的基因进行修饰改造可以产生一些人类需要的新品种。
随着现代分子生物学技术的发展和人类基因组图谱的完成，功能基因组学研究正大规模启动，基因打靶已成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。通过基因打靶将外源基因在ES细胞或体细胞中进行定点整合并高效表达，利用显微注射和核移植技术生产转基因动物具有广阔的发展前景。基于基因打靶途径建立的医学病理动物模型在人类遗传性疾病的基因治疗中发挥着不可估量的巨大作用。基因打靶技术将对哺乳动物发育生物学、免疫学、肿瘤神经生物学和医学遗传育种等学科产生深远的影响。所有这些，必将带来二十一世纪人类医学史上的一次革命。
参 考 文 献
1. Müller U. Ten years of gene targeting: targeted mouse mutants, from
vector design to phenotype analysis . Mech Dev,1999, 82(1-2):3
2. 杨晓, 黄培堂, 黄翠芬. 在小鼠进行基因打靶的研究进展. 科学通报, 2000, 45(15): 1584
3. 杨晓, 黄培堂, 黄翠芬, 编. 基因打靶技术. 北京: 科学出版社, 2003
4. Capecchi Mr. Gene Targeting . Sclentific American, 1994, 270(3):34
5. Torres RM, Kuhn R. Laboratory protocols for conditional gene targeting . Oxford: Oxford University Press, 1997
6. Gail RM. Isolation of a pluripotential cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells . Proc Nati Acad Sci USA, 1981, 78(12): 7634
7. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 1981, 292(9): 154
8. Shamblott MJ, Axwlmao J, Wang S et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Nati Acad Sci USA, 1998, 95: 13726
9. Bradley A, Evans M, Kansfman MH, et al. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature, 1984, 309: 255
10. Sikorski R, Peters R. Transgenics on the internet. Nature Biotechnol, 1997, 15: 289
11. Hasty P, Reuer-perez J, Bradley A. The length required for gene targeting in embryonic stem cells . Mol Cell Biol, 1991,11: 5586
12. Jung S, Rejewsk YK, Radbruch A. Shutdown of class switch recombination by deletion of a switch region control element. Science, 1993, 259: 984
13. Mansour SL, Thomas KR, Capecchi MR. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature 1988, 336: 348
14. Reyret JM, Pelicic V, Gicquel B, et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity, 1998, 66(9): 4011
15. Sedivy JM, Sharp PA. Positive genetic selection for gene disruption in mammalian cells by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989, 86(1):227
16. Schwartzberg PL, Goff SP, Robertson EJ. Germ-line transmission of a c-abl mutation produced by targeted gene disruption in ES cells.Science. 1989, 10; 246:799
17. Jasin M, Elledge SJ, Davis RW, et al. Gene targeting at the human CD4 locus by epitope addition. Genes Dev 1990. 4(2): 157
18. Yang X, Li C, Xu X, et al. The tumor suppressor SMAS4/DPC4 is essential for epiblast proliferation and mesoderm induction in mice. Proc Nati Acad Sci USA, 1998, 95: 3667
19. Yang X, Castilla HL, Xu X, et al. Angiogenesis defects and mesenchymal apoptosis in mice lacking SMAD5. Development. 1999,126: 1571
20. Yang X, Letterio JJ, Chen L, et al. Targeted disruption of SMAD3 results in impaired mucosal immunity and diminished T cell responsiveness to TGF-β |
|
发表于 2007-10-10 19:26:32