免疫荧光细胞组织化学技术

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1.荧光染色注意事项
(1)染色反应最好在湿盒内进行,以免标本上试剂干燥.染色试剂的干燥是造成非特异性染色反应的原因之一.
(2)染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜(PH=7.4左右),因此,切片冲洗液及抗体稀释液均应注意酸碱度的调整.
(3)组织细胞要求新鲜,最好使用冷冻切片,固定存档标本要求组织结构完好.
(4)切片经染色后,应及时观察并照相,不宜长期保存,以免褪色.切片在4度冰箱内过夜,其荧光强度将减弱约30%.
(5)抗体稀释度以获得最佳染色效果,背景非特异性染色最小为标准,因此对每一批抗体必须试验摸索,找出最佳稀释度.
(6)为防止抗体效果下降,所购抗体应及早试验,并应尽量减少抗体溶液的冻融次数.
(7)若非特异性染色过强时,在染色反应前应先将荧光抗体离心,去除沉淀物后再使用.
(8)缓冲甘油的配制方法:取纯甘油20ml,加入0.5ml/L PH9.5碳酸缓冲溶液20ml,充分混匀.

2.荧光显微镜标本制作要求
(1)载玻片:载玻片厚度应在0.8--1.2mm之间.太后的玻片,一方面吸光太多,另一方面不能使激发光在标本上聚焦.载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光.一般无需用荧光载玻片.
(2)盖玻片:盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁.为了加强激发光,也可以用干涉盖玻片.这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利透过,而反射激发光,这种反射的激发光又可以激发标本.
(3)标本:组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部为充分激发.另外,细胞组织重叠或杂质掩盖影响判断.
(4)镜油:一般暗视野荧光显微镜和镜油观察标本时,必须使用镜油.最好使用特制的无荧光的镜油,也可用缓冲甘油代替.液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响.

3.使用荧光显微镜注意事项
(1)应在暗室中进行检查,进入暗室后,接上电源,点燃超高压红灯5---15mins,待光源发生强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本.
(2)防止紫外线对眼睛的损伤.在调整光源时应戴上防护眼镜.
(3)检查时间以每次1--2h为宜,超过90mins,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱,标本受紫外光照射15mins后,荧光也明显减弱.所以最多不得超过2---3h.
(4)荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源.灯熄灭后欲再使用时,须待灯泡充分冷却后才能点燃.1天中应避免数次点燃光源.

4.荧光图像的记录方法
荧光显微镜所看到的荧光图像,一是具有形态学特征,二是具有荧光的颜色和亮度.在判断结果时,必须将二者结合起来判断.结果记录根据效果指标,即凭工作者目力观察,作为一般定性观察,基本上是可靠的.随着科学技术的发展,在不同程度上采用客观指标记录判断结果,如用细胞分光光度计,图像分析仪等仪器.但这些仪器记录的结果,也必须结合主观的判断.

5.荧光抗体的保存
保存荧光抗体一要防止抗体失活,二是防止荧光素不脱落和不受激发猝灭.一般认为0--4度可保存1--2年,-20度可保存3--4年.宜小量分装,禁止反复冻融.保存前需加防腐剂(一般加入浓度1:5000--1:10000的硫柳汞或1:1000--1:5000叠氮钠防腐)和除菌.真空干燥后更易长期保存.

6.荧光亮度的判断标准
一般分四级,\"-\"------无或可见微弱荧光,\"+\"-----仅见明确可见的荧光,\"++\"------可见明亮的荧光,\"+++\"------可见耀眼的荧光