硼砂甲苯胺蓝染液在半薄切片染色上的应用

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为了确定超薄切片的方向及选取需要的研究部位,可在超薄片机上选切取数张0. 5～2μm 厚的半薄切片进行染色。半薄切片的染色方法很多,其主要目的在于短时间内确定电镜观察的部位,从而提高电镜观察的准确性,因此要求染色的方法及步骤要简便、快捷,且染色效果好。通过多年的实践,我们对常用的甲苯胺蓝染色方法[ 1 ] 进行了改良,将硼砂甲苯胺蓝染液用于半薄切片的染色,取得了满意的效果,现将方法介绍如下。
1 　材料与方法
取经透射电镜常规制样Epon 812 包埋后的组织块于超薄切片机上,切取厚度为0. 5～2μm 的半薄切片,将其移到涂有蛋白甘油加水滴的载玻片上,然后于37 ℃烘箱内烘干待染(若急用,可于酒精灯上加热烘干) 。将硼砂甲苯胺蓝染液滴在切片上,约3～5 min 左右(若室温较低,可于酒精灯上加热数秒钟,但不能沸腾) ,用洗瓶冲洗切片上多余的染液,滤纸吸干水分,自然干燥,即可镜检。硼砂甲苯胺蓝染液的配制:取硼砂(又名四硼酸钠,开原化学试剂厂生产) 1 g ,用100ml 双蒸水加热溶解后,再加入甲苯胺蓝( 北京化工厂生产) 1
g ,待全部溶解过滤,室温下保存。
2 　结果
染色后的切片经光镜下观察,见组织细胞被染成蓝色,结构清晰,树脂无着色且染色适度。
3 　讨论
半薄切片是超薄切片前组织观察定位很重要的一个步骤,染色良好的半薄切片能够提供石蜡切片难以分辨的细节,并有助于克服电镜观察视野局限的缺点。经环氧树脂包埋的标本,一般需先脱树脂,否则染料不易渗入影响染色效果[ 2 ] 。目前用于半薄切片的染色方法有很多,而选择理想的染色剂是非常重要的。甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色团。助色团能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力, 使切片上的组织细胞着色。
甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两个助色团,为硷性染料,甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。常规用的甲苯胺蓝染色方法,以0. 1 mol/ L 磷酸缓冲液(pH 7. 2～7. 4) 为溶剂,磷酸缓冲液呈弱硷性。而硼砂(Na2B4O7 ·10H2O) 水溶液呈强硷性(pH 9. 3 ) ,以其代替磷酸作为缓冲液,配制的甲苯胺蓝染色液,大大地提高了组织细胞的着色力。比较改良前后两种甲苯胺蓝染色液,改良后的染色液不仅不需脱树脂快速易染,而且时间易掌握,组织细胞结构更清晰。尤其对临床穿刺标本在短时间内确定电镜观察的部位,提高其电镜的观察效率更有意义。另外,改良后的染色液,保存时间比改良前长,因为磷酸缓冲液的缺点是时间稍长便容易产生沉淀,同时也容易生长细菌[ 3 ] 。值得注意的几个问题是: (1) 染色前的载玻片要涂一层蛋白甘油,以防止切片脱落。(2) 由于温度对染料的溶解度与着色力有很大的影响,若快速染色,当室温较低时,可以适当加温。(3) 由于甲苯胺蓝为碱性染料,有明显的易染性,此种易染性经酒精脱水时大部分被破坏,因此染色后的切片不能经酒精脱水,而以水洗为好。(4) 染液可以室温保存。
【参考文献】
[1 ] 应国华. 医学·生物学电镜技术与细胞超微结构[M] . 香港:香港现代出版社,1993. 54.
[ 2 ] 杭振镳,蔡文琴. 电子显微镜技术在临床医学的应用[M] . 重庆:重庆出版社,1988. 24.
[3 ] 朱丽霞,程乃乾,高信曾. 生物学中的电子显微镜技术[M] . 北京:北京大学出版社,1983. 13.