灭菌方法介绍

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灭菌方法介绍
灭菌方法介绍
采用无菌技术所达到的程度，可以是不同的。一般分为灭菌、消毒和防腐3个不同层次。
灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。
消毒：它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，
防腐：抑制物体内外微生物的生长。

灭菌法系指用热力或其他适宜方法将物质中的微生物杀死或除去的方法。
本法适用于无菌、灭菌制剂、敷料和缝合线等生产过程中的灭菌。对产品(包括最终容器及包装)而言，选择灭菌方法的效果，必须在实际应用前予以验证。在执行GMP的原则下，灭菌方法的灭菌效果与灭菌设备的性能、污染菌的特性、被灭菌品的性质、受污染的程度等因素有关。应采取必要的措施降低被灭菌品灭菌前的微生物污染及灭菌后的再次污染。

一、物理灭菌法
（一）湿热灭菌法
本法系指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段杀灭细菌，灭菌能力甚强，为热力学灭菌中最有效及用途最广的方法。药品、药品的溶液、玻璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化或损坏的物质，均可用本法灭菌。
1.湿热灭菌的有关参数
(1)D值
D值即微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%(即使之下降一个对数单位)所需的时间，以分(钟)表示。D值越大，说明该微生物的耐热性越强。不同的微生物在不同环境条件下具有各不相同的D值。
(2)Z值
Z值即灭菌温度系数，系指使某一种微生物的D值下降一个对数单位，灭菌温度应升高的值(℃)，通常取10℃。
(3)FT值
FT值为灭菌程序所赋予待灭菌品在温度T下的灭菌时间，以分(钟)表示。由于D值是随温度的变化而变化，所以要在不同温度下达到相同的灭菌效果，FT值将会随D值的变化而变化。灭菌温度高时，FT值就小，灭菌温度较低时，所需FT值就大。
(4)F0值
F0值即标准灭菌时间，系灭菌过程赋予待灭菌物品在121℃下的等效灭菌时间，即T=121℃、Z=10℃时的FT值。121℃为标准状态，F0值即为标准灭菌时间，以分(钟)表示。
(5)灭菌率L
L值系指在某温度下灭菌1分钟所相应的标准灭菌时间(分钟)，即F0和FT的比值(L=F0/FT)。当Z=10℃时，不同温度下的L值是不同的(见表1)。不同Z值下的灭菌率均可查得(见表2)。
(6)无菌保证值(SAL)(Sterility Assurance Level)
无菌保证值为灭菌产品经灭菌后微生物残存概率的负对数值，表示物品被灭菌后的无菌状态。按国际标准，规定湿热灭菌法的无菌保证值不得低于6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。
2.灭菌设备
湿热灭菌法常用的设备为高压灭菌器。一般为双层金属壁组成，是附带有温度计或温度探头、压力表、安全阀等装置的压力容器。其他如新式旋转灭菌器、塔式灭菌器等灭菌装置已被使用。
高压灭菌原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
  注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。
  关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。按容器大小不同，保压时间有所不同。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。
到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5MPa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。
  对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。
   对于一些布制品，如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭局20-30分钟。
   高压灭菌前后的培养基，其PH值下降0.2-.3单位。高压后培养基PH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高PH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的PH值变化幅度较大，甚至可大于2个PH值单位。环境PH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。
   高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。
   培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。
   为防止高压灭菌产生的上诉一些变化可用下列方法：
  （1）经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。
  （2）设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意PH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
  （3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。
（4）注意高压灭菌后培养基PH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的PH值常由5.8升高至6.48。而96小时后又回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。
3.灭菌条件及验证的基本要求
由于无菌保证值与污染菌耐热性及污染量有关，因此在药品生产的各个环节均应采取各种有效的手段(包括除菌滤过等措施)来降低待灭菌产品的微生物污染。放入灭菌容器内的物品表面必须洁净且不污染有机物质，外面应有适宜的包皮宽松的包裹，烧瓶、试管等容器的塞子应有金属箔、纱布或牛皮纸包裹，并用适宜的方式松缚，防止脱落。放入灭菌器内的物
品，不能排列过密。根据物品的性质可选择如下条件进行灭菌：
灭菌条件  温度（℃）  时间（min）
1  115.5  30
2  121.5  20
3  126.5  15

一个灭菌程序的总的标准灭菌时间F0，应包括加热及冷却过程。它可以用灭菌率对时间求积分的方法计算而得。
上述灭菌程序的F0值不低于8，经验证后，可认为符合要求。如遇产品对热极为敏感时，可允许湿热灭菌的标准灭菌时间F0低于8。但对F0低于8的灭菌程序要求采取特别的措施以确保获得足够的无菌保证值。除用生物指示剂进行验证外，还必须在生产过程中，连续地、严格地对微生物进行监控，证明灭菌后无菌保证值不低于设定的标准。

（二）干热灭菌法
本法系指物质在干燥空气中加热达到杀灭细菌的方法。空的玻璃器具、金属制容器、纤维制品、固体试剂以及若干湿热不易穿透的物质如甘油、液状石蜡、脂肪油等均可用本法灭菌。
用本法灭菌的物品必须是洗净且不沾染有机物质的，外面应有适宜的包皮宽松包裹或装入封闭的金属容器内。烧瓶、试管等容器的塞子应有金属箔或纱布包裹，并用适宜的方式松缚，防止脱落，放入干热灭菌箱内时，排列不可过密。通常可在如下条件下灭菌。
灭菌条件  温度（℃）  时间
1  160～170  2小时以上
2  170～180  1小时以上
3  250  45分钟以上

除热原：采用干热250℃ 45分钟灭菌也可除去灭菌粉针分装与冻干生产用玻璃仪器中及有关生产灌装用具中的热原物质。
干热灭菌程序也应验证，对热稳定的产品应规定污染菌的存活概率应小于10-12。
干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170℃持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免防碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。

（三）过滤除菌法
本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理，除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌从而达到无菌要求。过滤器材通常有滤柱、滤膜等。滤柱系用硅藻土或垂熔玻璃等材料制成。滤膜大多是聚合物制成，种类较多，如醋酸纤维素、硝酸纤维素、丙烯酸聚合物、聚氯乙烯、尼龙等，孔径为0.22μm。
滤器种类规格较多，发展较快。国外已普及，国内很多企业也已开始使用弹筒式过滤器等。新置的滤器应先用水洗净。事先灭菌或作在线灭菌，在除菌滤过前后均应作过滤器的完好性试验，即压力维持试验或起泡点试验。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能释放物质；不得使用有纤维脱落的过滤器，禁用含石棉的过滤器。为保证滤过除菌效果，应使用两个灭菌过滤器串连滤过法，或在灌装前再用已灭菌的无菌过滤器进行滤过的办法。
一个过滤器的使用时间应根据品种验证后决定，一般不应超过8小时。用LRV(log reduction value)来表示过滤器能力。LRV是表示在规定条件下，指定菌液通过滤器后截留在滤器上的孢子数的对数值。对0.22μm的滤器而言其每1cm2有效滤过面积的LRV应不小于7。
  在实际应用中，一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。
  一些化学成分在高温高压下回发生降解而失去效能或降低效能。经高温灭菌后赤霉素GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质。高温还可使碳水化合物和氨基酸发生反应。IAA，NAA，2，4-D、激动素和玉米素在高温下是比较稳定的。维生素具有不同程度的热稳定性，但如果培养基的PH值高于5.5，则维生素B1会被迅速降解。泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌，不能高温灭菌，否则会失去作用。
  防细菌滤膜的网孔的直径为0.45微米以下，当溶液通过滤液后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。
过滤除菌操作步骤：首先将过滤器、接液瓶用纸包好，滤膜可放在培养皿内用纸包好。使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30分钟；在超净工作台上，将滤器装置装好，用灭菌无齿镊子将滤膜安放在隔板上，滤膜粗糙面向上；然后将待除菌的液体注入滤器内，开动真空泵即可过滤除菌。滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。

（四）射线灭菌法
1.紫外灭菌
在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌。一般在操作前，照射30min左右即可达到灭菌效果。
紫外线灭菌的原理:紫外线灭菌是用紫外线管照射进行的。波长在220-300纳米的紫外线称为“杀生命区”，其中以260钠米的杀菌力最强。紫外线作用于细胞DNA，使DNA链上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体），抑制了DNA复制。另外，空气在紫外线照射下可以产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能力很差，适用于空气及物体表面的灭菌，与被照物的距离以不超过1.2米为易，照射时间以视紫外线灯管的功率大小、被照空间及面积大小，根据灭菌效果测定结果而定。由于紫外线对人体有伤害作用，因此，不要在紫外线灯照射下进行操作。

2.辐射灭菌
本法系通过将最终产品的容器和包装暴露在由适宜放射源(通常用60Co)辐射的γ射线或适宜的电子加速器发出的射线中，达到杀灭细菌的目的。对上述三种方法不适应的医疗器械、容器、不受辐射破坏的药品等均可应用。
常用灭菌最小吸收剂量为25kGy(千拉德)，使用其他剂量时应事先进行验证。当剂量小于25kGy时，应在照射前后增加微生物检测，并用适当的化学和物理方法测定被测物质吸收的射线剂量，以确证该剂量是否适合。如采用涂有对照射敏感染料的塑料，当射线通过时根据其发生的颜色变化进行计量，并建立计量规程。在初安装时计量仪应用标准源进行校正，以后可在适当的时间间隔内校正。

二、化学灭菌法
用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。不能杀死芽胞，仅对繁殖体有效。目的在于减少微生物的数量，控制一定水平的无菌状态。
（一）气体灭菌法
利用环氧乙烷气体、甲醛蒸气、丙二醇蒸气等杀菌性气体进行杀菌的方法。环氧乙烷可应用于粉末注射剂、不耐热的医用器具、设施、设备等。甲醛气体、丙二醇气体适用于操作室内的灭菌。
用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
  化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。
常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。

环氧乙烷灭菌法：本法系将产品暴露在充有环氧乙烷的环境中，使之达到灭菌的目的。本方法适用于气体中稳定的物质。由于环氧乙烷本身具有毒性，且与空气以一定比例混合时有爆炸危险，因此灭菌程序的控制具有一定难度。整个灭菌过程应在有技术熟练的人员监督下进行，并应具有微生物试验的足够设备。应注意本方法仅适用于与该灭菌气体适合的供试品。
环氧乙烷的灭菌效果与气体浓度、温度、暴露时间、湿度以及物质性质有关，在灭菌过程中，当待灭菌品在腔室中达到一定的温湿度平衡时，方可开始通入环氧乙烷进行灭菌。应监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及暴露时间，并通过分布在物质周围的生物指示剂得以监控灭菌效果。
被灭菌物质暴露在环氧乙烷或带适量惰性气体的混合气体中完成灭菌后，应给以足够时间或采取适当措施使残留环氧乙烷和其他易挥发性残渣消散。并应采用适当方法对灭菌后的残留物加以监控。

（二）化学药剂灭菌法：
利用药液杀灭微生物的方法。该法常应用于其它灭菌法的辅助措施。常用的有0.1%\"0.2%苯扎溴铵溶液，2%左右的酚或煤酚皂溶液，75%的乙醇溶液。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表：
灭菌剂名称  使用浓度%  消毒难易  灭菌时间（min）  灭菌效果
酒精  70-75  易  0.1-3  好
氯化汞  0.1-0.2  较难  2-10  最好
漂白粉  饱和溶液  易  5-30  很好
次氯酸钙  9-10  易  5-30  很好
次氯酸钠  2（活性氧）  易  5-30  很好
过氧化氢  10-12  最易  5-15  好
抗菌素  4-50mg/L  中  30-60  较好

上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒去除，所以应当用无菌水漂洗8-10次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒。
在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。

灭菌原理简介：
1.酒精：具有较强的穿透力和杀菌力，它使细菌蛋白质变性。使用的浓度一般为70%-75%。处理时间15-30秒，不宜太长，因为细胞容易收缩脱水。它具有浸润和灭菌的双重作用，适用于表面消毒，但不能达到彻底的灭菌，必须结合其它药剂灭菌。
为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱,以改变细胞表面带电荷的性质而增加膜透性,提高乙醇的杀菌效果。
2.氯化汞：氯化汞也称升汞，是一种剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌的原理是Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合，使细菌蛋白变性，酶失活。氯化汞使用浓度0.1%-0.2%，浸泡6-12分钟时，就可以有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌芽孢，灭菌效果极好。
但用氯化汞灭过菌的外植体材料要用无菌水反复多次洗涤（一般不少于5次），才可将残留的药剂除净。使用氯化汞给环境造成污染，一般情况下，应尽量用其它消毒剂灭菌，而以少用或不用氯化汞为易。
3.漂白粉：为白色粉末，一般含10%-20%（质量/体积）的次氯酸钙[Ca(ClO)2],使用时用饱和溶液，杀菌的原理在于它分解出具有杀菌作用的氯气。氯与蛋白质中的氨基结合，使菌体蛋白质氧化，代谢功能发生障碍。注意漂白粉腐蚀金属、棉织品，刺激皮肤，易吸潮散失有效氯而失效，平时要密封储藏，最好现配现用，不要储藏太久。
4.次氯酸钠：又称为“安替福民”，活性氧含量是0.8%,使用时稀释3-5倍,浸泡外植体5-30分钟,再用无菌水洗涤4-5次.它分解出具有杀菌作用的氯气,灭菌后易于除去,不留残余,杀菌力强,对植物材料无害,是植物组织培养常使用的杀菌剂之一。
5.高锰酸钾：能使细菌酶蛋白中的基氧化成二硫基而失去酶活性。浓度稀释时起氧化作用杀死细菌，日常生活中通常用作皮肤、果蔬的表面消毒剂，在一盆清水中加几粒高锰酸钾就可起到杀菌的作用。

【附】生物指示剂
生物指示剂用于监测灭菌效果，应是一个标准的对灭菌条件稳定的微生物。
1.选择生物指示剂的要求
(1)实验用菌种要稳定。
(2)实验用菌种的耐受性应大于产品可能被污染的微生物的耐受性。
(3)实验用菌种应无致病性。
(4)实验用菌种在规定条件下保存，菌种不得变异。
2.常用生物指示剂
各灭菌方法验证用生物指示剂，可以用任何方式放置于指定的位置。但应避免接触到被灭菌物质。
(1)用于湿热灭菌法的生物指示剂
(i)嗜热脂肪芽孢杆菌(B.Stearothermophilus)孢子(如NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953)
(ii)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)孢子(如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)

(2)用于干热灭菌法的生物指示剂
枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)(如NCIMB 8058、ATCC 9372)
D的定义与湿热灭菌类似，但Z取20℃，如应用于去热原计算时，则Z取54℃。

(3)用于滤过灭菌法的生物指示剂
(i)黏质沙雷菌(Serratin marcescens)(ATCC 14 756)
(ii)缺陷假单孢菌(P.Diminuta)

(4)用于辐射灭菌法的生物指示剂
短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)(如NCTC 10 327、NCIMB 10 692、ATCC 27 142)
活孢子数在107～108的生物指示剂，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。
本方法中的D值表示在计算系统(log system)下的吸收剂量。

(5)用于环氧乙烷灭菌法的生物指示剂
枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)(如NCTC 10 073、ATCC 9372)。
本方法D值表示在特定杀菌条件下的时间(分)。