病毒分离前样品的实验室处理方法

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病毒分离前样品的实验室处理方法 病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。

(一) 组织器官样品的处理
1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1-2 ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1-2 ml继续研磨，逐渐制成10%-20%的悬液；
2.加入复合抗生素；
3.以800×g离心15min；
4.取上清液用于病毒分离。必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩（见下文）。

(二) 粪便样品的处理
1.加4g的粪便于16ml Hank’s平衡盐容液中制成20%的悬液；
2.于密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃球；
3.以6000×g低温离心30min，取上清液再次重复离心；
4.用450nm的微孔滤膜过滤；
5.加二倍浓度的复合抗生素。然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。

(三) 无菌的体液（腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品　
可不做处理，直接用于病毒分离。
注：Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。

(四) 样品的特殊除菌处理　
样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。

1.乙醚除菌　对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过液。取用下层水相分离病毒。
2.染料普鲁黄（Proflavin）除菌　由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。
3. 过滤除菌　可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或者200nm孔径的混合纤维素酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。
4. 离心除菌　用低温高速离心机以1800r/min（15.24cm）离心20min，可沉淀除去细菌，而病毒（小于100nm）保持在清液中。必要时转移离心管重复离心一次。

(五) 待检样品中病毒的浓缩　
对病毒含量很少的病毒样品一般普通方法不易检测或分离出病毒，必须经过浓缩。常用浓缩方法如下：
1.聚乙二醇（PEG）浓缩法　将分子量6 000的PEG逐步加入经一般处理的样品溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。以3000×g离心15min，用少量含复合抗生素的Hank’s平衡盐溶液重悬，心要时用450nm微孔滤器除去真菌孢子。
2.硫酸铵浓缩法　将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液中边加边搅拌，置4C过夜。离心同上。
3.超滤器浓缩法　是一种高效率的浓缩法，特别适合大体积的样品浓缩。详见实验仪器。
4.超速离心浓缩法 以40 000r/min（15.24cm）离心60-120min ,绝大多数病毒将沉于管底。用少量Hank’s平衡盐溶液悬浮病毒。这种方法回收效率很高，但仅适用于小体积的样品。

(六) 病毒分离样品脂类物质的去除
有些病毒样品（如组织样品）脂类和非病毒蛋白含量很高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂抽提。常用的有机溶剂有正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等。方法是将预冷的等量有机溶剂对半加入样品中，强烈振荡后，1000×g离心5 min，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。