GUS定量测定方法

yujian623

GUS测定
——测定细胞裂解产物中β-葡糖苷酸酶活性的权威方法（特别针对大肠杆菌、红球菌、棒状杆菌的富集与裂解的实验方案）
Jennie Cho,（改编xian o’brien，校订Phil Lessard）
改编自Wilson等所著《大肠杆菌的gus操纵子：gus 操纵子在大肠杆菌和其他菌种中的诱导和表达》一文。选自Sean R. Gallagher编的《GUS方案：用 GUS 基因作为基因表达的报道基因》， 学院出版社，1992.
培养物收集
  4. 在培养的适当时间点吸取1.6ml培养液到2ml微量离心管中，置于冰上。
  5. 快速漩涡混匀1.6ml样品并将100μl样品移入装有900μl新鲜培养液的分光光度计小杯中。离心分离剩余的1.5ml样品，弃上清，并将沉淀立即于-80℃下保存。（注：样品必须保存在-80℃，而非-20℃）
  6. 测量并记录样品1：10稀释物的OD600值。（注：样品的OD600值将会是计算GUS活性的考虑因素）

细胞的裂解
  8. 在冰上解冻沉淀。
  9. 将沉淀重悬浮于374μl B-PER™ 细菌蛋白质提取试剂 (穿刺产物78248)，50μl蛋白酶和磷酸脂酶抑制剂的混合物用于细菌细胞筛选(Sigma product P8465; 按照厂家指示配制), 1μl 34mg/ml 的氯霉素（在甲醇中制备），以及6μl 10mg/ml 的溶菌酶（在蒸馏水中制备；而当实验对象是大肠杆菌时，可忽略）
  10. 充分漩涡混匀1min
  11. 在冰上培育5min
  12. 到这一步，得到的是浑浊细胞裂解液原液，可以用原液根据下一步骤中得到的产物的nM量/分钟﹡OD600单位来测定GUS的活性（注：这一步骤对棒杆菌和红球菌使用的效果最好）
  13. 对于大肠杆菌样品，将原液旋转混匀1min后，将其置于冰上。
  14. 这一步得到的是澄清的细胞裂解液（上层清液含有细胞碎片）。此菌液的蛋白质浓度可以用Bradford方法来测定（见此方法的分离方案）。清液也可用来测定GUS活性，使用下面的方案以产物的nM量/分钟•mg蛋白质来测定酶活。（注：每mg蛋白质的活性是一种比每OD600单位活性更为恰当的测量方法，思考一下为什么）

GUS的测定
  1. 将细胞裂解液在冰上保存
  2. 制备新鲜的GUS测定缓冲液，将其预热至37℃
  3. 准备随时可用的小试管（每次测定至少需3个），每支中装有800μl的0.4M Na2CO3（反应中止液）
  4. 为每个样品准备一个装有800μl在第二步中准备的 GUS 测定缓冲液的2ml微量离心管，加入200μl细胞裂解液到离心管中（这使PNPG的最终浓度为1mM）。记录时间
  5. 在37℃下进行反应，记录时间。（注：水浴保温是更为可取的，但关键是温度的稳定。）注意观察黄色的出现（ρ-硝基酚）。不少于三次（比如15,30,45mins）从每个样中取出100μl放入分光光度计小杯中。（注：当测定的是浑浊的原液时，轻轻敲打并翻转反应管，取上层液100μl于分光光度计小杯中。）快速的漩涡震荡反应管，马上将其重新


  
置于37℃下。取样的时间间隔不一定要相同，但是一定要记录每次的取样时间
6. 在405nm下测定每个时间点样品与空白对照反应相比的吸光率。（注：停止反应后，反应体系的颜色是稳定的。相比于分次测定吸光率，一次测定所有时间点样品能减少实验误差。）

反应率的计算
  1. 对每个样品都做一个以OD405值为y轴，时间为x轴的图表。计算图表中线形图型的斜率（OD405 单位/分钟）。（或者用Excel作图计算。）
  2. 每个样品的反应速率（nM产物/分钟/OD600 unit)** 是：

R = S/(0.02 x V x OD600)
V代表体积，单位ml。在此实验中，V=0.02ml，因为0.2ml样品是用在起始反应(步骤3)中，并且十分之一的样品（100μl）在每个时间点被移出并停止反应（步骤4）。分母中的0.02是从ρ-硝基酚的消光系数得到的。在这个方案的条件下，ρ-硝基酚的消光系数是18000。在900μl的最终反应体系中，0.02的吸光率代表了1nmol产物量。
**反应速率也可以用下面公式计算：（nM产物/分钟/ mg蛋白质）
R = S/(0.02 x V x 蛋白质浓度)
也可以用Bradford方法来测定每个样品的蛋白质浓度。


试剂
GUS 测定缓冲液
[50 mM NaPO4, pH7, 1mM EDTA, 5mM DTT, 1.25mM PNPG]
50 mL:
49.13 mL GUS 缓冲储备液
250 uL 1M DTT
625 uL 100mM PNPG
新鲜制备并预热至37℃
GUS缓冲储备液
[50 mM NaPO4, pH7, 1mM EDTA]
200 mL：
7.8 mL 0.5M NaH2PO4
12.2 mL 0.5M Na2HPO4
0.4 mL 0.5M EDTA, pH8
加蒸馏水180mL
提前制备于室温保存。DTT和PNPG在使用前添加
0.5M NaH2PO4
500 mL：
34.5g 无水NaH2PO4
加蒸馏水至500mL
提前制备于室温保存
0.5M NaH2PO4
500 mL：
35.5g 无水NaH2PO4
加蒸馏水至500 mL
提前制备于室温保存
0.5M EDTA
200 mL：
溶解37.22 g Na2 EDTA•2H2O于140 mL蒸馏水中，用10 N NaOH (~10 mL) 调pH至8.0
加蒸馏水至200 mL
提前制备于室温保存。

1M DTT
10 mL：
1.54 g DTT
加蒸馏水至10ml
提前制备，在-20℃下按1 mL等份溶液保存
100mM 对硝基苯-β-D-葡萄糖酸 (PNPG)
1 mL：
0.032g PNGP
加GUS缓冲储备液至1 mL
新鲜制备于冰上保存。
0.4 M Na2CO3 (反应停止液)
500ml：
21.2g Na2CO3
加蒸馏水至500mL
提前制备于室温保存。
10 mg/mL 溶菌酶
(作用于红球菌和棒杆菌)
1 mL：
10mg 溶菌酶
加蒸馏水至1mL
新鲜制备于冰上保存。B-PER™ 细菌蛋白提取试剂
穿刺待用产品78148, 500 mL
用于细菌细胞提取的蛋白酶和磷酸脂酶抑制剂的混合物
Sigma产品 P8465
按照厂家指示配制
提前制备于-80℃下200 uL 等份保存
34 mg/ml氯霉素
10 mL：
340 mg氯霉素
加甲醇至10 mL
提前制备于-20℃ 下按1 mL等份溶液保存