大板聚丙烯酰胺凝胶的银染

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聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。

需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。

下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验

测序凝胶的银染
　　染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 　　
　　1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 　　
　　2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 　　
　　3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 　　
　　4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 　　
　　5. 凝胶显影：
　　　(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
　　　(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
　　　(3). 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。 　　
　　6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。 　　
　　7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
　　8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。

经验分享：
（1）固定液：网上有好几种固定液的配制方法，我们采用的是10％的冰乙酸，用蒸馏水稀释即可，简便易行。可提前配制，室温放置。
（2）染色液：我们用的是0.1％的硝酸银溶液，加入3ml甲醛。硝酸银要现用现配，时间长了硝酸银会分解，一般在固定的时候配制，要有一段时间让硝酸银充分溶解。
（3）显影液：用10％碳酸钠，北化的质量就不错，完全不用买进口的，显影液要提前配制，放入4度冰箱预冷。这一步很重要，如果没有充分预冷，显色时很难控制显色时间，不是染过了导致背景很高，就是染的很浅。因此在固定前就要把显影液配好。
（4）在2L显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制，这一步要在显影前加，不要提前加。原理忘记了，但是一般都是这样做的。
   甲醛将银离子还原为金属银，硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的，根据凝胶染色的效果决定。当时我是把甲醛调整为2.7ml，硫代硫酸钠改为420μl，两者作用不一样，所以调整的时候一个多，一个少，而且要微调。具体什么方向调整忘记了，需要摸索最合适的条件。
（5）也是比较重要的，即一定要分两次显色，第一次显色出现条带后马上转移至剩下的显影液中。显色时间第一次大概是5分钟左右，操作中一定要在边上看着。显色后马上放入终止液（10％的冰乙酸）中，两分钟后放入纯水中即可，两分中后取出即可。
（6）对我来说教训最为惨痛的，即显色时间的控制。第二次显色时不要等所有条带都出来后再终止，因为显色有一个延续效应。当时我染色时，忽然走神了，就走神5秒钟，胶全黄了，背景奇高。我两天的工作因为5秒钟全部over了，当时差点疯了。
  我的经验是：当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止，具体时间需要摸索，但一定要提前终止。再加一句：万一染色浅了是可以复染的，效果差不太多。