Ecotilling 方法

yujian623

一、  引物设计
充分了解候选基因的exon/intron/UTR 区域在基因组中的位置，
选择一段1200到1600bp的区域，使之5’ and 3’端为UTR或exon，将之保存为fasta 格式，利用Primer3进行引物设计，需满足以下条件：
  引物长度最短设置为20bp, 最长设置为30bp，最佳值为24或 25bp.
  Tm值最低设置为67℃，最高设置为72℃，最佳值为70℃.
  扩增产物长度最短设置为800bp, 最长设置为1200bp，最佳值为1000bp.
  GC含量最低设置为20%，最高设置为80%，最佳值为50%.
从生成的引物中选择最合适的一对。将此引物定出合成，若扩增结果符合期望，则接下来定制相应的荧光标记的引物，以IRD700标记左引物，以IRD800标记右引物。荧光引物以1×TAE（PH7.4）稀释分装后避光保存于-80℃。


二、  PCR
将不同品种DNA分别与参照DNA各取1.25ng等量混合，并使模板总体积为5ul。
其他成分配方如下：



其中引物混和物包括3:2的IRD700标记的和不标记的左引物，以及4:1的IRD800标记的和不标记的右引物。引物混和物可于4℃保存一星期，在-80℃可保存更长时间（几个月）。
以下是PCR采用的程序：


采用Touchdown 扩增程序有利提高特异性，变性退火程序有利于形成异源杂合双链。


三、  CEL1 酶切反应



其中10× CEL1 buffer的配方如下：


用排枪将以上CEL1混和物加入PCR反应产物中，混合均匀，于45℃反应15分钟。立即放冰上，加5ul0.225M的EDTA以终止反应。
然后在每孔中加入3ul3M的醋酸钠及60ul异丙醇，混合均匀，在-80℃放置至少1小时。
5000rpm离心30分钟，去上清，每孔加100ul75%乙醇，5000rpm离心10分钟，去上清，在65℃烘箱中烘10分钟。
每孔加入5ul formamide loading dye + 10ul 双蒸水，在85℃烘箱中放30分钟，直至终体积大约为1.5ul.
将浓缩后的产物用铝箔包好放冰上直至点样（也可在4℃保存一周）
formamide loading dye 配方如下：




四、  制胶
洗玻璃板：带一干净新手套，先用洗涤剂搓洗，再用自来水冲洗，直至无小颗粒，再用双蒸水冲洗。放在架子上晾干。
配胶：
6.5% acrylamide gel mi× 配方如下：
尿素      8.4克，
50% LR acrylamide  2.6ml
10×TBE     2ml
用滤膜将胶过滤一遍，然后再加入APS及TEMED（在倒胶之前再加）。
各成分比例如下:



倒胶：
将晾干的玻璃板内面用75%乙醇再擦一遍，将两板内面相对而放，中间夹有spacer，再用夹子将板子固定好。倒胶时将玻板稍倾斜，慢慢注入，注意不要产生气泡，若有气泡可用配套的钩子钩出，胶慢慢前进到另一边刚刚流出即可。制好后反插梳子，再将扣压板装上去拧紧。放置2小时后备用。


五、  在Li-Cor 4300系统中进行PAGE凝胶电泳
接通电源，打开电脑，按下Li-Cor 4300 power按钮，打开电脑桌面上命名为Saga 的文件夹，里面有两个文件，鼠标点击打开右边文件，接着点击左边文件，出现对话框，用户名及密码均输入user.创建及编辑gel manager文件。
将制好的胶的板面洗干净并用75% 乙醇擦干净，插梳子（有48孔，64孔，96孔梳子，可根据需要选择），然后将之安装于Li-Cor 4300仪器上，安装电泳槽，配1升1×TBE缓冲液加于上下电泳槽，关闭机门，预电泳25分钟。
打开机门，取下上电泳槽盖，用注射器吹打泳道赶走气泡，用Hamilton 8- channel syringe上样，盖上槽盖，关闭机门，然后开始电泳，通常需4小时。在电泳过程中可实时监测电泳图像，电泳完后图像（类似下图示例）自动保存到C盘。