胶体金制备

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金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。迄今为止，金标记仍主要用于免疫组织化学中。在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的简便、快速检验方法。

第一节 免疫胶体金的制备
一、 胶体金的特性和制备
（一）胶体金的结构
胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。
（二）胶体金的特性
1．胶体性质胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。
2．呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金（2～5nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（10～20nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。
3．光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λmax）在510～550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λmax偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长，表19-1所列为部分胶体金的λmax。
（三）胶体金的制备
1．制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸（HauC14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下：
（1）将HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。
（2）搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7•2H2O）水溶液。
（3）继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min。
（4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。
用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。
四种粒径胶体金的制备及特性
胶体金粒径（nm）  1％柠檬酸三钠加入量（ml）*  胶体金特性 （呈色 λmx ）
16            2.00           橙色 518nm
24.5          1.50           橙红 522nm
41           1.00           红色 525nm
71.5          0.70           紫色 535nm

*还原100ml 0.01％HauC14所需量

2．注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。
（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
（5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。
肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。
胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。
二、 免疫金的特性和制备
（一）免疫金的特性
胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。
胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。
（二）免疫金的制备
1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。 在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再胶体金的pH值。
2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。
3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。
4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。
5．轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。
6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。
多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。
一、  胶体金
即金的水溶液，它也具有一般溶胶的特性。分散体系的分类：体系就是一定空间范围内作为我们研究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质中所组成的体系叫做分散体系。被分散相质点的大小而改变，因此，按分散相质点的大小不同，可将分散体系分为三类。
（一）离子分散体系
指分数散相以小分子或离子状态分散着。这种溶液具有高度稳定性，无论放置多久，分散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从溶液中分离出来
（二）胶体分散体系
是指分散相颗粒在1～100nm之间的分散体系叫做胶体分散系。胶体溶液外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见它的分散相粒子，不易受重力影响与分散介质分离沉降，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向，即具有聚结不稳定性。
（三）粗分散体系
分散相颗粒是由许多分子组成，因粒子较大，用肉眼或显微镜即可看见，不稳定，极易因重力而自动沉降，外观浑浊不透明。
二、胶体金的一般性状
（一）胶体金的颜色
溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线和种类，是散射光还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短，对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色，20～40•nm之间吸收波长530nm，液体为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。
（二）胶体金的稳定性
溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的颗粒作布朗运动，不易受重力影响下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积较大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。胶体颗粒变大以致超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。②胶粒及其溶剂化层（溶剂是水就是水化层）的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。③胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。
（三）溶胶的聚沉现象
胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶颗粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。因为某种原因使溶胶颗粒带电量减到很小甚至中和；其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：
1．少量电介质对溶胶的聚沉作用　少量电介质即可使溶胶聚沉，但各种电介质的聚沉能力可用聚沉值来表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值从实验中得出如下的离子价规则：①电介质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用。②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价的增加而显著增加。电介质为什么能使溶胶聚沉呢？这是由于电介质与胶粒带相反电荷的离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电荷量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电层厚度缩至很小的溶剂化层变得很薄时，两个胶粒间便可以更加接近即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。胶粒的双电层结构见图5
2．温度对溶胶稳定性的影响 一般影响不大，当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加。
3．浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度。
第三节胶体金的制备技术
胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。
一、 制备胶体金的
（一）玻璃器皿的清洁
制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。
（二）试剂的配制要求
（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。
（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。
（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。把白磷在双蒸水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全溶解后即得饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保存。
二、制备胶体金的方法和步骤
（一）白磷还原法
1．白磷还原法（Z Sigmondy 1905年）
（1）取1%的HAuCl4水溶液1ml，加双蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。
（2）用0.2mol/L K2CO3调pH至7.2。
（3）加热煮沸腾，迅速加入0.5ml
20%白磷的饱和乙醚溶液，振荡数分钟至溶液呈现橙红色时即成。胶体金的颗粒直径为3nm左右，大小较均匀。
2．白磷还原法（Z Sigmondy 1905及Z Sigmondy Thiessen 1925）
（1）取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加双蒸水120ml 。
（2）用0.2mol/L K2CO3,调pH至中性。
（3）加入1/5饱和度的白磷乙醚溶液1ml（1份白磷4份乙醚），在室温振荡约15min，溶液呈红褐色，再加热至典型的葡萄酒红色，加热可使乙醚蒸发，胶体金液体内过量的白磷通入空气后被氧化，此方法获得胶体金颗粒的直径在5～12nm之间。
3．白磷还原法的改良法（Henegouwen 1986）
（1）取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml,加双蒸水60ml 。
（2）用1%的HAuCl4水溶液0.75ml, 加0.1mol/L K2CO30.6ml, 振荡变成棕红色。
（3）加热煮沸，至溶液变成透明红色。
使用上述方法增加还原次数使金颗粒直径不断增大，二者之间的关系见下表。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系
还原次数颗粒直径（nm） 正负误差
15.6           0.9
26.7           0.9
37.9           0.9
49.8           1.3
51.2           1.0

此方法主要优点是简化了制备不同大小的颗粒胶体金的手续和其它试剂的配制,经济、操作简单。另外，在多次还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒，只是在原先金粒子基础上使它的直径变大。第一次金颗粒起着“晶核”的作用。由于这一特点，制备的金颗粒相对均匀一致。
（二）抗体血酸还原法（Stathis and Fabrikanos 1958）
（1）将在4℃预冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/L K2CO31.5ml、双蒸水25ml混匀。
（2）在搅拌下加入1ml 0.7%抗坏血酸水溶液，立即呈现紫红色。
（3）加双蒸水至100ml，加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8～13nm。
（三）柠檬酸三钠还原法（Frens 1973）
此方法是由Frens在1973年创立的，制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表5-2。
表 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系
0.01%的HAuCl4（ml）    1%柠檬酸三钠(ml)     直径（nm）
100                5.0          10.0
100                4.0          15.0
100                1.5          25.0
100                1.0          50.0
100                0.75         60.0
100                0.60         70.0
100                0.42         98.0
100                0.32         147.0
100                0.25         160

按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越大。

（六）放射性胶体金的制备方法（Kent and Allen 1981）
（1）取0.01% HAuCl4 上水溶液100ml，加热至沸腾。
（2）加入40μl195Au。
（3）迅速加入4ml1% 柠檬酸三钠水溶液，5～7min出现透明的橙红色。
（4）其含量为I×106脉冲数/min。
（八）微波制备液体金方法。