Real-time PCR的前期准备

yujian623

细胞按要求培养，抽RNA, 反转录为cDNA。
有细胞计数，测RNA 浓度（分光光度计）等环节。
选择反应物，
待测样本：0hr, P4, L4, P12, L12, P24, L24, P36, L36 九种
阴性对照：即无模板对照， NTC
作为标准的样品：如果有必要做标准曲线的话，选择一种比较容易准确定量的DNA (如果是
进行绝对定量分析，则需要浓度完全已知的DNA 标准品——要求：能够被引物所扩增，比
如，其他种类细胞的cDNA, 或，克隆有DNA 片段的质粒载体)。
选择引物（基因）
endogenous control 使用的持家基因：GAPDH(甘油醛脱氢酶
转录水平待测的基因
因为每个反应管要做3 次重复以上，所以应该准备好充足量的 PCR 试剂，推荐——先混合
得到Master Mix, 再分至各个反应管。
※标准曲线和待测样品其实应该在同一次real time PCR 中做。第一次做的话，试验的成分
更多些，所以，重复数应该大一些（4），这样就不得不把标准曲线和待测样品分开了。等到
扩增曲线能够被完美地，轻松地得到后，就可考虑减少重复数（至少3 吧），