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摘 要 目的：通过测定肺心病患者血小板内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)和钙调蛋白(CaM)活性，探讨［Ca2+］i和CaM活性变化在肺心病、缺氧性肺动脉高压形成机制中的作用。方法：用荧光指示剂Fura-2/AM标记示踪法和磷酸二酯酶法测定19例肺心病急性发作期患者和20例健康者血小板［Ca2+］i、CaM活性。结果：肺心病组血小板［Ca2+］i、CaM活性显著高于对照组。肺心病组血小板［Ca2+］i与CaM活性呈显著正相关；与动脉血氧分压(PaO2)呈显著负相关；与动脉血二氧化碳分压(PaCO2)呈显著正相关。结论：肺心病患者［Ca2+］i和CaM活性增高在缺氧性肺动脉高压形成和肺心病发生机制中可能具有重要作用。缺氧、二氧化碳潴留是刺激［Ca2+］i增高的重要因素。
关键词：肺心病 血小板 细胞内游离钙 钙调蛋白
缺氧性肺动脉高压是慢性阻塞性肺疾患发展成肺心病的中心环节，其形成机理为缺氧直接作用于肺血管平滑肌细胞，使钙离子(Ca2+)内流增加，细胞内游离钙离子浓度［Ca2+］i增高所致［1］。本研究以肺心病急性发作期患者为对象，血小板为模板，通过对血小板［Ca2+］i和钙调蛋白(CaM)活性的测定及与PaO2、PaCO2之间的关系的分析，探讨［Ca2+］i、CaM活性在缺氧性肺动脉高压、肺心病时的变化和在缺氧性肺动脉高压形成机制中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 肺心病组：肺心病急性发作期患者19例，男12例，女7例，年龄38～71岁。全部病例均为Ⅱ型呼吸衰竭，PaO2均值(5.43±1.26) kPa、PaCO2均值(9.19±1.60) kPa。肺心病诊断标准符合1977年全国肺心病会议第二次修定标准。
1.1.2 对照组：血库献血员及门诊健康体检筛选出的正常健康者20例，男13例，女7例，年龄38～70岁。
1.2 研究方法
1.2.1 血小板［Ca2+］i检测：取受试者清晨空腹安静状态下肘静脉血6 ml，按6∶1加ACD抗凝剂(枸橼酸钠93 mmol/L、枸橼酸7 mmol/L、葡萄糖140 mmol/L)。离心1 000 r/min，10 min，20℃，取富含血小板血浆加入前列腺素E1(长春生物制品所提供)20μg混匀，离心2 000 r/min, 20 min, 20℃，弃掉乏血小板血浆，底部血小板用HEPES缓冲液(NaCl140 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgSO4 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucos10 mmol/L、pH 7.4)洗涤1次。用台盼蓝排斥反应检测血小板存活率达90%以上为合格标本。调整血小板浓度为1×108/ml。计数后的血小板加入Fura-2/AM(中国医学科学院药物所提供)10μl，37℃孵育40 min，避光，负载过程不断通以95%O2和5%CO2混合气体。负载完毕用HEPES缓冲液洗涤血小板，用荧光分光光度计(日立F-2000)直接测血小板［Ca2+］i。测定时激发波长350 nm、发射波长490 nm、光栅10 nm。
1.2.2 血小板CaM活性测定：取受试者清晨空腹安静状态下肘静脉血5 ml，EDTA-Na2抗凝。抗凝血离心1000 r/min, 10 min，取富含血小板血浆离心3000 r/min, 10 min，弃掉乏血小板血浆沉淀血小板用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(含1 mmol/L EGTA，pH 7.0)悬浮，100℃水浴中煮沸5 min，离心12 000 r/min，30 min，取上清加入等量4.5 mmol/L CaCl2溶液对半稀释。血小板CaM活性测定按照中国医学科学院基础所药理室提供CaM试剂盒说明书操作。血小板CaM活性单位用ng/mg protein表示。
1.2.3 动脉血气PaO2、PaCO2测定：用丹麦Radiomer公司产ABL3型血气分析仪测定。
1.2.4 统计学处理：结果以均数±标准差(X±s)表示，组间比较采用t检验，相关分析用直线相关分析。
2 结果
2.1 血小板［Ca2+］i测定结果：肺心病组血小板［Ca2+］i为(202.14±84.05) nmol/L，显著高于对照组(88.50±17.00) nmol/L(t=5.78，P＜0.01)。
2.2 血小板CaM活性：肺心病组血小板CaM活性(9.43±5.08) ng/mg，显著高于对照组(3.55±2.15) ng/mg(t=4.67，P＜0.01)。
2.3 肺心病组血小板［Ca2+］i与PaO2，PaCO2和CaM相关分析：肺心病组血小板［Ca2+］i与PaO2呈显著负相关(r=-0.64，n=19，P＜0.01)；与PaCO2呈显著正相关(r=0.49，n=19，P＜0.05)；与CaM活性呈显著正相关(r=0.75，n=19，P＜0.01)。
3 讨论
本研究应用目前国内先进而且灵敏性、特异性强的荧光指示剂Fura-2/AM(化学名为2-［6-双乙酸氨基-5-(2-双乙酸氨基)-5-甲苯氧乙氧基］-2-苯骈呋喃基-5-?唑羟酸的乙酰羟甲基酯)测定细胞内发挥活性的游离钙方法。比以往应用原子吸收光谱法测定细胞内总钙能更准确地表达出细胞内发挥活性的钙离子水平。
血管平滑肌细胞和血小板在收缩结构、调节系统和细胞内第二信使系统等方面有许多相似之处。因此，在对血管平滑肌细胞内Ca2+代谢等方面研究中，均以血小板为研究模板［2］。本研究结果显示，肺心病组血小板［Ca2+］i和CaM活性均显著高于对照组，推测在肺心病急性发作期、缺氧性肺动脉高压时，肺血管平滑肌细胞［Ca2+］i和CaM活性增高。细胞［Ca2+］i是血管平滑肌兴奋—收缩的偶联因子，当细胞［Ca2+］i增高时与CaM结合形成Ca2+-CaM复合物，激活细胞内肌球蛋白轻链激酶，使肌球蛋白轻链磷酸化、最终引起血管平滑肌收缩。肺心病急性发作期时血小板［Ca2+］i和CaM活性增高，在缺氧性肺血管收缩、肺动脉高压形成中可能起着重要作用。
本研究结果得出肺心病组血小板［Ca2+］i与PaO2呈显著负相关，与PaCO2呈显著正相关关系，说明血小板［Ca2+］i受PaO2和PaCO2的影响。提示缺氧，二氧化碳潴留是引起［Ca2+］i增高的重要因素。蔡英年等［3］研究发现，缺氧引起的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞内45Ca2+明显增高。缺氧引起细胞［Ca2+］i增高机理［3，4］：①缺氧直接作用血管平滑肌细胞膜钙离子通道，使其结构和功能发生改变，致钙离子跨膜内流增加；②缺氧阻断肺动脉平滑肌细胞钙激活的钾通道开放，引起肺动脉平滑肌细胞去极化，相断开放钙通道，使［Ca2+］i增高。肺心病二氧化碳潴留引起［Ca2+］i增高的机理并不十分清楚，可能与二氧化碳潴留、酸中毒致细胞膜钠泵、钙泵功能障碍及膜的通透性发生改变有关。
本研究结果显示，肺心病组血小板［Ca2+］i与CaM活性呈显著正相关。有研究表明［5］细胞［Ca2+］i增高可使CaM由细胞骨架上转移到细胞浆内，活性增高，与［Ca2+］i结合致血管平滑肌张力增高，引起平滑肌收缩。肺心病时细胞［Ca2+］i和CaM活性的异常增高在缺氧性肺动脉高压形成、肺心病发生中起着重要作用。
卫生部科研基金资助项目，94-1-200王莉(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)
吴凝萃(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)
于润江(中国医科大学呼吸疾病研究所，沈阳 110001)
参考文献
1，Voelkel NF. mechanisms of hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am Rev Respir Dis,1986,133:1186_1195
2，大岛哲也.血球细胞を用いての高压におけるCa代谢の研究.Therapeutic research, 1994,15(12):193～203
3，蔡英年，文允镒.慢性缺氧对大鼠肺动脉Ca2+跨膜内流和肺组织钙调蛋白含量的影响.科学通报，1987，5：380～382
4，Post JM, Hume JR, Archer SL, et al. Direct role for potassium channel inhibition in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am J Physiol,1992,262:C882_890
5，祖父江宪治.カルモデコリンの分布.蛋白、核酸、酵素，1982，27：2201～2210
http://blog.daifumd.com/_daifumd ... article_106694.html |
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发表于 2007-8-7 22:31:13
