它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子,如SYBR green 1等荧光染料。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法,在PCR反应体系中,加入过量SYBR green 1荧光染料,SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增,不需要探针的设计,使检测方法变得简便,同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合,因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合,使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线(melting curve)分析的软件加以解决。 扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物,它又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在real-time Q-PCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团,此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移,FRET),因此探针完整时,检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中,溶液中的模板变性后低温退火时,引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响)将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光,分子信标(molecular beacon)就属于这一类,它本质上是一种标记荧光的发夹探针,当探针分子呈发夹结构时,结合在其两端的荧光基团距离上接近,使得产生能量转移效应,而不发生荧光。当互补序列出现时,探针与DNA杂交,探针转变成一个开放的结构,呈线性,报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离,荧光基团脱离了淬灭基团的影响,从而产生可被检测到的荧光。