DNA分析PCR

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DNA分析

根据个体的基因组序列，用限制性核酸酶对DNA消化，产生不同长度的DNA片段。例如，某一个体的DNA上具有Hind Ⅲ的切割序列AAGCCT，这种酶会在出现上述序列的位置将DNA切割成许多片段。因此，如果嫌疑人S1有50个限制性（即切割）位点，而嫌疑人S2有55个限制性位点，这两个个体的DNA片段将产生不同的带型。每条片段的大小取决于限制性位点之间的距离。这种片段数量和大小的差异通常称作多态性，是由于所切割的DNA的多种形态造成的。

　　DNA图象的获得，动物、植物、微生物DNA的图象可通过对DNA的分析而得到。简化的方法可包括以下七步：

1、
收集生物样品：血液、唾液、精液、头发、牙齿、骨骼以及其他来自个体的细胞组织或液体。

2、
DNA提取：从样品中分离DNA。根据方法的不同，少量样品就足够了，如从个体帽子上发现的前额皮肤的脱落细胞。或者在电话上留下的唾液滴甚至在邮票上也能留下足够的可供分析的DNA。

3、
DNA消化：下一步是用限制性核酸酶对DNA切割。其中Hind Ⅲ、EcoR I是经常使用的酶。在DNA用限制性酶处理后，产生一系列大小不同的片段。

4、
片段分离：通过电泳对DNA进行片段大小分离。这一过程包括把DNA溶液点样入凝胶，并放入电泳槽。通常选用琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖是一种从海藻中提取的物质，而海藻的成分与明胶相似。将DNA点样在靠近负极的胶中的小孔里，电场使DNA片段从负极向正极移动。小DNA片段比大DNA片段泳动要快，从而使大小片段分开。


5、
DNA转移：DNA片段分离完毕，通过毛细作用将其转至尼龙膜上当这些片段吸附到膜上后就可以通过一定操作使其日后能观察到。

6、
与探针杂交：将萤光素或同位素标记过的探针加到尼龙膜上，与探针互补的DNA片段可显示出来。每个探针可使膜上几个典型的片段显示出来。

7、
DNA图象：在用不同的探针与膜杂交后可获得最后的DNA图象。这种图象就是不同大小的条带（亮点）带型。

　

PCR

　　Kary Mullis因利用细菌的DNA复制酶在体外进行DNA扩增而发明了PCR技术，并由此获得1993年的诺贝尔奖。今天，PCR不但用于科学研究当中，而且在实验室、临床、医院的遗传检测以及分析DNA证据的法医实验室等各方面都有实际应用。为了使PCR的特异性增强或者减弱，对PCR程序进行了许多改造，在遗传学领域PCR有很多重要的应用价值。PCR能使特异的DNA序列进行复制。PCR反应需要以下材料：

DNA膜板：所获得的DNA样本
核苷酸碱基：A、T、G和C
DNA聚合酶：DNA复制的酶
引物对：人工合成的与欲扩增DNA区域两侧序列互补的短片段特异性DNA序列。同时它也有助于聚合酶与DNA结合和功能的正常发挥
反应缓冲液
盐溶液
  PCR的程序开始于在核苷酸（A、T、C和G）、一对引物、聚合酶、缓冲液和盐溶液存在的情况下对样品DNA进行加热，使DNA分子变性，两条链分开。然后使样品冷却，引物此时与每条链杂交，使DNA聚合酶开始DNA复制。随着聚合酶在DNA模板链上的移动，核苷酸碱基加上去，形成与 模板DNA互补的拷贝。然后，对样品再一次加热使DNA变性，从而开始了一个新的循环。这种循环在DNA扩增仪里重复20-30次，使样品DNA上两侧引物区内的DNA片段扩增的数目呈指数增长。
PCR检测的标记

　　由于PCR的灵活性和特异性。应用这种技术已创造出多种区分个体遗传变异的方法，其中包括扩增片段长度多态性（AFLP）和SNP等等。这些不同的标记是因不同的方法或扩增DNA的不同部分而得到的，但所用的PCR反应的方法都是相似的，而目的都是为了区分不同个体间的变异。有些方法已经完全自动化，比如SNP的检出，就是利用质谱或DNA芯片上的杂交而得到的，现在它已成为药物基因组学发展的重要工具。

  基于PCR的分子标记不同于RFLP标记，因为前者只需要非常少量的NDA就能进行分析。利用专门的仪器和能使DNA复制的酶就可对感兴趣的区域进行扩增。由于这些标记获得的速度快，整个过程又不费力气，因而为DNA分析带来了一场革命。为了懂得这些分子标记的用途，必须首先懂得PCR的原理。

　　依据PCR技术，已经创造出了一系列分子标记。其中部分标记包括短串联重复（STR）即微卫星DNA、随机扩增多态DNA（RAPD）、SNP即点突变、AFLP和序列特征扩增区域（SCAR）。这些分子标记用来进行人、动物、植物和微生物遗传变异的研究。
STR（微卫星DNA）

在有些生物的染色体中含有短重复序列DNA，这些短序列有2-6个核苷酸长，可以重复好多次。遗传学家发现这些短重复序列可作为极有价值的分子标记，并用专门的PCR技术对它们进行研究。这些序列称为STR或短序列重 复（SSR），亦即微卫星DNA。比较常见的重复序列是二核苷酸CA或三核苷酸CAT。这些标记群位基因组的一定区域，呈串联（即一个接着另一个）重复，至少5组为一个单位。这些重复单位是高度可变的和多态的，并由不同的重复单位数目而形成一系列等位基因。
这些区域非常容易通过PCR扩增，而且由于它的多态程度高，所以被用来进行犯罪调查中的个体识别和遗传变异分析。PCR扩增后，其产物可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将大小分开。每一个微卫星DNA最多可呈现两条带，表明该个体具有不同的等位基因（从双亲中各得到一个）。