PLoS Biol.：Morpholinos进行miRNA活性敲除新技术

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PLoS Biol.：Morpholinos进行miRNA活性敲除新技术 生物通报道：GeneTools公司最新文章描述了一种利用吗啉寡聚核苷酸（Morpholinooligonucleotides，MF）进行miRNA活性敲除、成熟敲除和特异控制的新技术。microRNA调节基因特别是一大组基因的表达，在胚胎发育、心脏功能、癌症发生等过程中扮演重要角色。miRNA研究的最新发现改变了我们对基因调节的认识，出现了许多miRNA活性的新报道。miRNA活性的实验操作已经成为分子生物学的一种标准工具，但这些技术目前仍处于改进中。microRNA的成熟过程分为几个阶段。初级miRNA(primarymicroRNA)转录自DNA，并折叠为一个stem-loop。酶Dros


  生物谷报道：Gene Tools公司最新文章描述了一种利用吗啉寡聚核苷酸（Morpholino oligonucleotides，MF）进行miRNA活性敲除、成熟敲除和特异控制的新技术。

  microRNA调节基因特别是一大组基因的表达，在胚胎发育、心脏功能、癌症发生等过程中扮演重要角色。miRNA研究的最新发现改变了我们对基因调节的认识，出现了许多miRNA活性的新报道。miRNA活性的实验操作已经成为分子生物学的一种标准工具，但这些技术目前仍处于改进中。

  microRNA的成熟过程分为几个阶段。初级miRNA(primary microRNA)转录自DNA，并折叠为一个stem-loop。酶Drosha将stem-loop与转录本(transcript)其它部份分开，接着酶Dicer将loop与stem分开。双链stem与蛋白Argonaute相互作用，Argonaute将双链劈开，释放其中的一条链，与剩下的一条链（guide strand，引导链）形成miRISC复合体。miRISC复合体与mRNA相互作用，改变mRNA的表达。

  miRNA的活性敲除通常利用靶向miRNA引导链的寡核苷酸。靶向miRNA的Morpholino oligonucleotides也能干扰miRNA的活性。单独利用这种技术很难控制敲除的特异性。然而，靶向未成熟miRNA的溶核加工位点（nucleolytic processing sites，生物通编者译）的Morpholino，能够抑制miRNA的成熟。如此，靶向初级miRNA的成套的不重叠的Morpholino oligos，可以用于特异控制；如果靶向同一个miRNA的两个不重叠的oligo引发的表型相同，就能说明表型是由于靶miRNA的活性被敲除引起的，而非脱靶效应。这种技术的详细内容刊登于：
Kloosterman WP, Lagendijk AK, Ketting RF, Moulton JD, Plasterk RHA. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biol. 2007;5(8): e203.

biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-pdf&file=10.1371_journal.pbio.0050203-L.pdf
已刊载电子版。

  GENE TOOLS公司成立于1997年，位于AVI Biopharma公司旗下，是一家生产生物学和医学研究所需的序列个性化的Morpholino oligos的生物技术公司。其Morpholino产品从2000年开始商业化，目前已经有1700篇研究型论文涉及到Morpholino。

  GENE TOOLS的初级产品Morpholino反义核苷酸，是合成分子，阻断特定基因活性的Morpholino。Morpholino的亚单位的连接顺序决定了受其阻断的目的基因。GENE TOOLS公司根据客户需要，设计关闭目的基因活性的个性化Morpholino。GENE TOOLS公司通常每周能够合成200多个Morpholino。

  GENE TOOLS的客户一般是大学、研究所和制药公司的研究人员。
  发育生物学家通过将Morpholino oligos注入卵子或者斑马鱼、青蛙、海鞘、海胆等的受精卵中研究胚胎发育

细胞生物学家利用Morpholino oligos研究新经过测序的基因的功能

医疗工作者利用Morpholino oligos研究癌症等疾病的细胞学机制

想获得关于Morpholino oligos的更多信息，请登陆GENE TOOLS网站（www.gene-tools.com）并阅览文章（en.wikipedia.org/wiki/Morpholino）

原始出处:

PLoS Biology

Received: October 13, 2006; Accepted: May 22, 2007; Published: July 24, 2007

Targeted Inhibition of miRNA Maturation with Morpholinos Reveals a Role for miR-375 in Pancreatic Islet Development
Wigard P. Kloosterman1, Anne K. Lagendijk1, René F. Ketting1*, Jon D. Moulton2, Ronald H. A. Plasterk1

1 Hubrecht Laboratory-KNAW, Utrecht, The Netherlands, 2 Gene Tools, Philomath, Oregon, United States of America

Several vertebrate microRNAs (miRNAs) have been implicated in cellular processes such as muscle differentiation, synapse function, and insulin secretion. In addition, analysis of Dicer null mutants has shown that miRNAs play a role in tissue morphogenesis. Nonetheless, only a few loss-of-function phenotypes for individual miRNAs have been described to date. Here, we introduce a quick and versatile method to interfere with miRNA function during zebrafish embryonic development. Morpholino oligonucleotides targeting the mature miRNA or the miRNA precursor specifically and temporally knock down miRNAs. Morpholinos can block processing of the primary miRNA (pri-miRNA) or the pre-miRNA, and they can inhibit the activity of the mature miRNA. We used this strategy to knock down 13 miRNAs conserved between zebrafish and mammals. For most miRNAs, this does not result in visible defects, but knockdown of miR-375 causes defects in the morphology of the pancreatic islet. Although the islet is still intact at 24 hours postfertilization, in later stages the islet cells become scattered. This phenotype can be recapitulated by independent control morpholinos targeting other sequences in the miR-375 precursor, excluding off-target effects as cause of the phenotype. The aberrant formation of the endocrine pancreas, caused by miR-375 knockdown, is one of the first loss-of-function phenotypes for an individual miRNA in vertebrate development. The miRNA knockdown strategy presented here will be widely used to unravel miRNA function in zebrafish.

全文链接：

http://biology.plosjournals.org/ ... ournal.pbio.0050203

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本期Cell封面：miRNA敲除研究



miRNA简介：microRNA（miRNA,微RNA）即为长度为22nt左右的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。
miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。同时，科学家们也发现人类基因组中大约有255个编码miRNA基因，约占人类基因数的1%，但尚不清楚其功能。最近科学家发现小RNA 与‘epigenetic’现象有联系。所谓epigenetic 是指并不涉及遗传序列的特征性的遗传改变。有人已试图将小RNA 用于抗病毒治疗之用,认为它们有可能抑制HIV21 和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治疗。

miRNA与siRNA之间有许多相同之处：
1.二者的长度都约在22nt左右。
2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。
3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。
4.二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。5.miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。

miRNA与siRNA的不同点：
1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。
2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。
3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。
4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。
5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。
6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。