DNA浓度和纯度的测定

yujian623

原理
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，
      dsDNA浓度约为50μg / ml
     ssDNA浓度约为37μg / ml
     RNA浓度约为40μg / ml
     寡核苷酸浓度约为30μg / ml（youyu底物不同有差异）
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。
经验值：
纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）
若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。

材料、试剂及器具
1、 材料
提取的PUC19样品、PUC19标准样品
2、 试剂
灭菌重蒸水，TE缓冲液
3、 器皿
石英比色皿；UV-240紫外分光光度计

操作步骤
1、 UV-240紫外分光光度计开机预热10min.
2、 用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。
3、 设定狭缝后校零。
4、 将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记
  录编号和稀释度。
5、 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。
6、 设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。
7、 计算待测样品的浓度与纯度。
DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000

RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000

溴化乙锭法


原理
溴化乙锭（EB）是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA或RNA链的堆积碱基之
间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA吸收254nm的紫外辐射并传递能量
给EB，而EB本身在302nm和366nm处有光吸收。吸收的能量在590nm处释放，并表现为橙红色
荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。EB结合量的多少与DNA的大小和构型有
关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型的同种DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入
量与样品溶液的DNA含量成正比。

材料、试剂及器具
1、 标准DNA样品:已知浓度的线型DNA，以TE稀释为梯度浓度的一系列标准样品。
2、 质粒DNA的酶切样品（待测）
3、 溴化乙锭（EB）5μg / ml：以PH8.0的TE稀释10mg/ml母液而的。
4、 紫外透射仪。

操作步骤
黑色塑料板（或其他替代物）在其上点上两排溴化乙锭2μl液滴，每排六点
取标准样品2μl与第一排溴化乙锭混匀，则各点的DNA浓度分别为（单位：ng/μl）:20、15、
10、5、2、1取待测样品经过梯度稀释后，各加2μl于第二排的溴化乙锭上混匀 梯度稀释（单
位：μl）把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上关好样品室门。以短波紫外光激发荧光。观察
每一点的荧光强度或拍照。比较上下两排得亮度，确定待测样品的浓度。

注意事项
1、 标准样品含单一种类的DNA，且大小与待测样品相近。
2、 待测样品和标准样品使用同样的体积.
3、 EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。
4、 沾有EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。

实验报告
1、 绘出所观察到的现象（以点的密度代表亮度）
2、 请估算待测DNA原液的浓度。
要求记录测定原始数据，计算待测样品的浓度和纯度；并对你的实验结果作出评价，提出下一步提纯工作的设想