流式细胞仪操作规程

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流式细胞仪的使用程序
                  ------分子病毒实验室


一．开机程序
1．  检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．  打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．  将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。
4．  如果需要打印，打开打印机电源。
5．  打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．  执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．  分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
。做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

二．  预设获取模式文件(Acquisition Template Files)
1．  从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．  选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．  选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．  将此视窗命名后储存于FACStation G3\\BD Applications \\CELLQuest Folder \\EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
.  本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\\BD Applications \\CELLQuest \\EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。

三．  用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1．  从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。
2．  从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键： ＋B）进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．  从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1，2，3，4获得此四个对话框。
4．  在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2，而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDM Param选择FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log进行测量。
5．  放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。
6．  在Acquisiton Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。
7．  在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages（粗调）与Amp Gains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
8．  在Threshold 对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号（细胞碎片）。一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。
9．  从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10．  在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。
11．  在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2- 的细胞群却分布在FL1＋ FL2＋区域内，则需调大FL2－？％FL1中的“？”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12．  在Status对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW，Standby为5mW；Laser current:正常值为6Amps左右。
13．  调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。
.  本计算机中已有三个名叫储存于FACStation G3 \\BD Applications \\CELLQuest Folder \\IMM-InstrSettings及FACStation G3 \\BD Files \\Instrument Settings Files \\CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件，前二者可用于分析人白细胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。

四．  通过预设的获取模式文件进行样品分析
1．  从苹果标志中选择CELLQUEST，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。
2．  从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．  从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set 确定。
4．  在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA时选择1024。Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。
5．  在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation G3\\BD Applications \\CELLQuest \\IMM 和DNA 文件夹中。文件根据日期命名。
6．  在Cytometer指令栏中，选择Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。
7．  将样品试管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。
8．  微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort, 去除Setup前的“”，开始正式获取信号，存储数据。
9．  当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7，继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。
. 当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。

五．  关机程序：
1．  从File中选择Quit, 退出软件，选择Don’t Save至苹果屏幕。
2．  用4ml 1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去约2ml，在将样品架置于中位（vacuum is off），再HIGH RUN 5分钟（内管吸去2ml）。
3．  改用三蒸水4ml作样品,同上处理。
4．  按Prime三次。
5．  此时仪器自动转为STANDBY状态，换2ml三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY”状态 10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。
6．  填写使用登记表。