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SDS－PAGE and Western Blot
一．溶液配制:
1．SDS-PAGE相关溶液
(1).电极缓冲液：
Tris: 6g
甘氨酸： 28.8g
(10% )SDS: 10ml
加1000 ml H2O PH:8.3
(2).分离胶buffer: 100ml:
Tris:36.6g
1N HCL 约48ml): PH:8.9
加水至：100ml
(3). 浓缩胶buffer: 100ml:
Tris: 5.98g
1N HCL约48ml): PH:
加水至：100ml
(4).凝胶贮存液： 100ml:
Acr:30g
Bis:0.8g
加水至：100ml
(5). 4Xloading buffer:
2-Me: 20% 2ml
SDS: 8% 0.8g
Glycerin: 40% 4ml
Bromophenol Blue: 0.4% 0.04g
Tris-CL (ph6.8) 240mM 2.5ml(浓缩胶buffer)
加1.5ml H2O
total: 10ml
(6) 染色液(快速染色配方，染色1小时
0.1% Coomassie blue, 10% acetic acid, 45% methanol
考马斯蓝R-250 1g
甲醇 450ml
水 450ml
冰醋酸 100ml
(7). 脱色液：1000ml
冰醋酸： 75ml
甲醇： 50ml
水： 875ml
2．Western blot相关溶液
(1) 转移缓冲液：称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37 SDS，200ml甲醇，加去离子水至1000ml，如果蛋白分子量小可不加SDS。
(2) PBS－T： NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4•12H2O 2.9g, 溶于800ml去离子水中，用盐酸调PH值为7.4，定溶至1000ml，加0.05％Tween20。
(3) 封闭液：5%脱脂奶溶于PBS中
(4) 氨基黑染液：0.2%氨基黑溶于7%乙酸中。
(5) 氨基黑脱色液：30%甲醇, 10%冰醋酸溶液。
3．细胞裂解液
（1）Buffer A: 25 mM Tris pH 7,5
50 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM EDTA
5 mM dithiothreitol (DTT)
（2）细胞核裂解液
Buffer NE:
25 mM Tris pH 7,5
0.42 M NaCl
1.5 mM MgCl2
0.5 mM EDTA
1 mM dithiothreitol (DTT)
25% Sucrose
0.2% SDS (免疫沉淀不加)
裂解细胞前加入蛋白酶抑制剂至终浓度为 100 mg•L-1 PMSF, 1 mg•L-1 Aprotinin, 2 mg•L-1 Leupeptin
二．步骤
SDS-PAGE电泳
按照胶配置方法配制不同浓度PAGE胶，电泳置染料抵达分离胶底部，断开电源。 取下凝胶，
Western Blot
1. 电泳结束后，切下带有要转移蛋白泳道的凝胶用，右下角作一标记以确定方向及正反面。
2. 剪1块与凝胶大小相同的NC膜（不能大于凝胶），右下角作一标记，浸泡于转移缓冲液中，大约5分钟。
3. 剪8块新华1号滤纸，右下角作一标记，其大小略与凝胶相同（不能大于凝胶）。
4. 将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡，按阳极到阴极（从下至上）顺序安装转移装置: 平放底部电极，在底部电极上放置4张浸泡好的滤纸,精确对齐，将NC膜放在滤纸上，排除气泡。把SDS-PAGE 电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗，平放于NC膜上，用玻棒挤出所有气泡。在其上再放置4张浸泡好的滤纸，排出气泡。
5. 将上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶面积按1mA/cm2接通电源，电转移2~4h。100mA,2h。
6. 转移结束后，去除滤纸。把凝胶转移到考马斯亮蓝染液的托盘中染色，以检查蛋白转移是否完全。剪下含分子量标准的NC膜放在氨基黑染液中染色30秒，氨基黑脱色液脱色。
7. 将转移上蛋白的NC膜以蒸馏水略洗稍干后，浸在封闭液中4℃封闭过夜，然后用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。
8. 将膜与第一抗体室温孵育2h，第一抗体用PBS-T缓冲液按不同稀释度稀释以摸索最合适的一抗浓度，然后PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。
9. 将膜与HRP标记的羊抗鼠IgG(1:5000)共同孵育1h，PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。
10. 配制发光底物（按1：1混合底物液）。
11. PBS-T缓冲液洗涤后在化学发光底物显色2分钟，凝胶成像系统观察照相。（或DAB显色液中避光显色~15分钟，出现条带后立即以水冲洗以中断显色反应）。 |
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发表于 2007-7-20 08:09:02