应用抗体芯片对白血病免疫组型的分析

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Larissa Belov, Odetta de la Vega, Cristobal G. dos Remedios,
Stephen P. Mulligan, and Richard I. Christopherson
Departments of Biochemistry [L. B., O. d. l. V., R. I. C.] and Anatomy and Histology,
Institute for Biomedical Research [C. G. d. R.], University of Sydney, NSW 2006,
and Department of Hematology, Concord Hospital, Concord, NSW 2139 [S. P. M.], Australia

不同的白血病在它们的质膜上表达247个特定的区别抗原(CD抗原)，这些抗原可能代表了前体细胞沿着分化系统分化成成熟骨髓细胞和淋巴白细胞。CD抗原表达（免疫组型）在鉴定白血病上是应用流式细胞检测，它一般只能辩认三个CD抗原。通常，结合形态学、免疫组型、细胞化学和染色体组型方法来诊断白血病和淋巴瘤。我们已发展了一套简单方便的方法，它运用抗体芯片能同时检测50甚至更多的在白细胞或白血病细胞CD抗原。那些表达相应的CD抗原的细胞能与芯片上的抗体结合。对白细胞数目急剧上升的患者，相应的表达模式表现出这些细胞的免疫组型。对疾病早期患者，根据与正常白血球不同的表达模式来诊断疾病。人们已经在正常外周血白细胞、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、毛细胞白血病、斗篷细胞淋巴瘤、急性骨髓白血病，以及T细胞急性成淋巴细胞白血病上获得了独特的表达模式。在CLL细胞上的CD抗原的表达模式来自20个患者，这些患者按细胞结合的递减次序依次为CD44, HLA-DR, CD37, CD19, CD20, CD5, CD52, CD45RA, CD22, CD24, CD45, CD23, CD21, CD71, CD11c, 和 CD9。 能辨别CLL与正常外周血白细胞最好的抗原是CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, 和 CD37。48个CD抗原的表达分析比流式细胞分析更为有优势。芯片能进行广泛的免疫组型分析，以及结合到抗体芯片上的细胞可以进行进一步的鉴定，如使用可溶性的、荧光标记的抗体。

引言
  血液细胞起源于干细胞。干细胞可在细胞因子如集落刺激因子的控制下，分化及增生扩散成骨髓与淋巴系统(1,2)。不同起源的前体细胞表达不同的表面分子，其中大部分表面分子，现在被定义为CD抗原。白细胞质膜上CD抗原与各种各样的生理功能相关，如细胞之间的相互作用，细胞因子受体，细胞信号转导，离子通道，转运蛋白，酶，免疫球蛋白以及各种支持分子（2）。当细胞随特定的系统分化时，CD 抗原的表达也随之变化，比如当表达CD43的骨髓干细胞分化成粒性白细胞时，接着开始表达CD13和CD33，并抑制CD34的表达。成熟的嗜中性粒细胞表达抗原CD11b,CD13,CD15,CD33的表达基本上被抑制了。白细胞的CD抗原的表达通常是根据流式细胞仪来检测。但是，流式细胞检测方法耗体力，价钱昂贵，需要荧光性标记的抗体，而且一次性只能分析3-4个CD抗原。
白血病的主要类型有源自未成熟T或B淋巴细胞的ALL，源自未成熟骨髓细胞的AML，源自成熟B淋巴细胞的CLL，源自粒细胞前身的慢性骨髓白血病（5）。由于循环的淋巴瘤细胞，NHL也被认为是一种白血病（5）。准确的血液诊断使我们可以选择最有效的治疗手段。目前，对急性白血病的诊断是根据对原始血细胞的形态学与细胞化学的分析，通常还要补充染色体组型及免疫组型的分析（5）。应用单克隆抗体对白血病进行流式细胞检测，对骨髓和淋巴急性白血病的诊断能达到98%的准确性（9），能区分一系列的慢性白血病与淋巴瘤（5）。根据WHO/FAB的标准，基于形态学分析，CLL可分为典型与非典型两个亚型（6，7），这有重要的预后意义。有很多研究表明，非典型的形态学，三体12和异常的免疫组型有很强的一致性（10）。

  在AML中，突变可以引起发育改变，导致在特定分化期终止分化细胞的增殖。或者，AML起因于以特殊方式分化的白血病干细胞（11）。使用WHO/FAB的分类标准，根据形态学，与过氧化物酶和苏丹黑染料的反应，CD13、CD14、CD33、CD41、CD61和血型糖蛋白A的表达，细胞质颗粒的类型，奥尔棒，液泡，染色体位移（8；21 或 15；17），染色体16的倒置，11q23异常，非特异的酯酶和氯代醋酸盐酯酶活性，血清和尿中溶解酵素水平和周期的acid schiff 染色，AML被分为很多亚型（6，12）。Jennings和Food（4）综述了基于抗原表达的模式与强度，流式细胞仪在白血病和淋巴瘤上的应用。他们发现有限的免疫组型不能独特的定义FAB分类的AML。然而，50-100个抗原表达的筛选会产生与现存分类相一致的占多数的模式。同时，它为WHO骨髓瘤形成的分类的生物学水平上的相关修改提供了方便（6）。Bain（5）发现AML的8个不同的FAB亚型，其9个表面抗原的不同的表达水平。对ALL来说，免疫组型在分辨临床上相关的亚型起着重要的作用。WHO认为ALL应根据细胞与一组血统相关的抗体的反应的模式来分类（6）。

  Golub 等（13）使用DNA芯片技术对来自38个患者骨髓的AML和ALL进行了基因表达研究。 对6817个基因进行了定量分析，大约有1100个基因在AML与ALL之间是差异表达的。50个基因与AML-ALL差异是紧密相关的，它们被用来对新样品进行更高精确的分类。Alizadeh等（14）使用一个含有17856个cDNA克隆的“Lymphochip” 对96个正常与恶性淋巴细胞样品的扩散大B细胞淋巴瘤的基因表达进行分析。鉴定出两种不同形式的淋巴瘤，它们的表达模式表明B细胞分化的不同阶段。寡核苷酸芯片在分类白血病或淋巴瘤中的使用，操作是实验式与复杂的，与现在的诊断标准（形态学，免疫组型，细胞化学和细胞遗传学）很难协调，缺乏临床上的相关性。而且，在mRNA与蛋白水平以及而后的翻译后修饰，还存在着不确定的关系。

  Chang（15）证明了人外周血单核细胞与吸附于玻片上的小鼠抗人HLA-A2抗体（50nl）特异性结合，以及小鼠胸腺细胞与类似固定的抗
Lyt 2.1和抗Lyt 2.2的抗体结合。这种利用固定化的抗体来鉴定HLA抗原的同种抗免疫球蛋白的潜能，以及白细胞子集的比例已进行了广泛的讨论。但在这个程序上并没有相当大的发展。我们对这个方法进行了检测，我们把抗CD3，CD4，CD8，和CD19的抗体点在玻片上，然后与人Raji(B细胞Burkitt淋巴瘤)或CCRF-CEM（T细胞ALL）进行杂交。因此，我们发展了抗体芯片，称为LD芯片（纪念Lee Dixon）。

　

材料与方法
细胞系
  从American Type Culture Collection (Manassas, VA)获得CCRF-CEM（急性成淋巴细胞白血病），Raji（Burkitt 淋巴瘤），以及HL-60（急性髓细胞前身白血病），并在RPMI 1640 培养基（Trace Scientific, Melbourne, Victoria, Australia）上生长。该培养基还添加有10%小牛血清(CSL Limited, Parkville, Victoria,Australia)和50 mg/ml 庆大霉素硫酸盐(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)。

抗体芯片的构建
  这个程序已在PCT的申请中提到。PixSys 3200 Aspirate and Dispense System (Cartesian Technologies, Irvine, CA)被用来构建一个矩形芯片（0.72cm×0.4cm），首先在载玻片（Fast Slides, Schleicher and Schuell）上固定上一层硝化纤维膜，再点上60个不同的5nl的抗体，然后凉干。抗体是从下列公司购买：Coulter and Immunotech from Beckman Coulter (Gladesville, NSW, Australia), PharMingen from BD Biosciences (North Ryde, NSW, Australia), and Biosource International from Monarch Medical (Stafford City, Queensland, Australia). 这些抗体是于-20℃保存在0.1%BSA中（Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia）,使用浓度在25-1000 mg/ml。在白光盒上我们用肉眼可以看到抗体圆点，芯片的角落用铅笔标记。硝化纤维膜用含5% (w/v)奶粉(Diploma; Bonlac Foods, Melbourne, Victoria, Australia)PBS缓冲液封闭（室温下90min ）,再用水洗涤，干燥，于4℃枯燥保存。每一批芯片都要用细胞系和冷冻的外周血白细胞或知道显型的白血病细胞，来检测抗体结合的活性。

白细胞与LD芯片的结合
  正常人与白血病患者的外周血中分离白细胞（用EDTA或肝磷脂防止血液凝结）。首先使用Histopaque(Sigma Aldrich),作PBS洗涤，再用含1mM的EDTA的PBS重悬，使细胞达到 107个/ml，然后与LD芯片在室温下温浴30分钟（100ml悬浮液/片），没有结合上的细胞会被PBS柔和的洗涤掉。EDTA能明显的降低非特异性结合。热失活的人AB血清[10%（v/v）；Sigma-Aldrich]添加到AML细胞中，由于Fc受体结合，与所有的抗体结合。芯片再在含1%（v/v）甲醛（(Sigma-Aldrich)，2%（w/v）葡萄糖，以及0.05%（w/v）叠氮化钠的PBS中固定1h,然后再用PBS洗涤。

数据记录与分析
  使用非常规的暗视野显微镜（如带UPLan 4×物镜的Olympus BX60 荧光显微镜），观察结合的白细胞。冷凝器安置在阶段1位置，绿色滤光片固定在光源上。使用SenSys digital cooled CCD camera (1317×1035 pixels; Photometrics, Tucson, Arizona), PCI Frame Grabber, and “V” version 3.5 图象处理与分析软件（Digital Optics, Auckland, New Zealand）对图象进行记录和分析。使用Adobe Photoshop version 5.0 软件对图象进行处理,比较一套标准的强度渐增的矩阵来计算点密度。使用ImageQuant version 3.3软件进行量化分析。固定的芯片即使干燥以后，如果用PBS弄湿的话，重新可以在显微镜下观察。

流式细胞分析
  分离出来的外周血白细胞（106个细胞）与FITC-或PE-结合的抗体（Coulter or Immunotech），以及2%（v/v）热灭活的人AB血清（Sigma-Aldrich）在室温下温浴15分钟。用FACS缓冲液（含0.1% (w/v) BSA 和 0.1% (w/v) sodium azide的PBS）洗涤后，细胞用定色剂重悬，在FACS-calibur flow cytometer上分析，用488纳米冷氩离子激光，运行CELLQuest 软件（Becton Dickinson, San Jose, CA）。

共聚焦显微观察
  与白细胞温浴后，LD芯片再与CD3-FITC (Coulter; diluted 1 in 200 with FACS buffer) 和 CD19-PE (Immunotech; undiluted) 1:1 混合的混合物于室温下温浴10分钟。使用FITC-和PE-结合的同型对照抗体进行特异性的结合的检测。玻片再用PBS缓冲液洗涤,用SlowFade Antifade Kit (Molecular Probes; from Bioscientific, Gymea, Australia)进行固定。使用Leica TCS NT Confocal System (Microsystems, Heidelberg, Germany) 的Plan Opo 100×1.40–0.7 oil immersion objective，对玻片进行检测。使用Adobe Photoshop version 5.0 软件对图象进行处理分析。

结果

结果
  预备实验表明，多余的细胞聚合体和非特异结合的白细胞可通过以下方法降到最低：洗涤细胞以除去外在的营养物；添加螯合剂（EDTA）；把温浴温度从37℃降到22℃。在这样的条件下，很少甚至没有细胞聚合体在抗体芯片上被检测到，背景很低甚至没有。

  图1 表示三个独特的细胞系与含60个抗体点的芯片杂交的模式,并用非常规的暗视野显微镜观察。杂交点的强度反映了与特定位置上抗体结合的细胞的密度(Fig. 1a)。CCRF-CEM 细胞与抗体如CD4, CD5, CD7, CD8, CD38, CD44, CD45,CD45RO, CD71, 和 CD95 上有较高的杂交信号，但与CD3 和 CD52 信号较低(Fig. 1b). Raji细胞与CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD37, CD38, CD45, CD45RA, CD52, CD71, CD79b, CD80, 和 CD95有较高的杂交信号；与sIg的杂交信号适中；与CD154, k 杂交信号较低(Fig. 1c). HL-60与CD4, CD13, CD33, CD44, CD64, CD71, 和CD117杂交信号较高；与 CD11b, CD11c, CD15, CD38, CD45, CD45RO, CD95, 和 KOR (CD66c)杂交信号适中；与CD8, CD14, 和 CD16 杂交信号较低(Fig.1C)。图2说明，当Raji细胞（密度107 cell/ml）结合于HLA-DR和CD38抗体时，在样品的细胞密度与结合细胞的数量存在着线形关系。当样品的细胞在6×105 cell/ml时,很少甚至没有杂交信号被检测到。

  图3显示从正常组织与各种白血病病人的白细胞的杂交模式。正常外周血白细胞与30多个抗体有杂交信号。抗T细胞抗原的抗体（CD2, CD3, CD4, CD5,CD7）比抗B细胞抗原的抗体（CD19, CD20, CD21, CD22,CD23 和 CD24）能结合更多的细胞，反应为T淋巴细胞与B淋巴细胞之比为70:30,它们占了外周血白细胞的20-40%（17）。抗CD44与CD52的抗体与白细胞高强度结合，这在大多数白细胞中是一致。白细胞与CD13和CD33结合强度适中，反映出单核细胞/粒细胞在外周血中的浓度（>40%白细胞）。抗CD41和CD42a的抗体与血小板结合，同时抗glycophorin A（CD235a）与红细胞结合。在新鲜的白细胞准备液中都发现这两个类型细胞的存在。

  CLL病人中含有大量白细胞的样品 (>30×109cells/liter)，阳性斑点较少(<25; Fig. 3c)，密度均一，反映了单克隆CLL细胞相对于正常白细胞的优势(4–10×109cells/liter; Ref. 17)。对于白细胞数较少的CLL病人来说(8–14×109cells/liter; Fig. 3d)，其结合模式仍然可以与正常白细胞相区别，因为对应于B细胞抗原的点密度要大于或等于T细胞的点。我们还没有检测白细胞数小于8×109cells/liter的CLL病人，但是当CLL细胞和正常白细胞以1：3相混合（相当于血液白细胞总数5×109cells/liter）时CLL的模式仍然是明显的，提示LD array可用于检测较早期的白血病或淋巴瘤。
来自于一个HCL病人的白细胞(Fig. 3e)与抗CD103和FMC-7紧密结合，而不是CD23和CD5，与典型的HCL免疫表型相一致，从而与CLL区分开来。与抗CD5结合的小量细胞用可溶性抗CD3和抗CD20荧光标记后经共聚焦显微镜检测证明是T细胞。NHL(Fig. 3f)与CLL和HCL相比，具有B细胞免疫表型(CD51/ CD79b1/CD1032/FMC-71)。AML病人的白细胞模式是双表型的(Fig. 3f)，除了单细胞谱系抗原(CD4, CD11b, CD33, CD36, CD38, CD64, and HLA-DR)的表达外，还有T淋巴细胞标记CD2的表达。该免疫表型通过流式细胞仪确证。所有的白细胞都有T细胞免疫表型(Fig. 3h)。从LD微阵列获得的HCL, NHL, 和T-ALL (Fig. 3, e, f, and h)的免疫表型和由病理实验室提供的流式细胞数据非常吻合。

  用LD array确定的两个CLL病人白细胞中48个抗原的表达与流式细胞仪非常接近（表1），尤其是高水平表达的抗原。当FACS分析显示总群体的75–100%有抗原表达(CD5, CD19, CD20, CD24, CD37, CD44, CD45RA, CD52, and HLA-DR; patient 7)，即表示发生了高水平的结合。35–75%的表达(CD9, CD11b, and CD21; patient 7)与中度结合相关，而15–35%的细胞表达抗原结合较弱(CD22, CD45RA, CD79a, and GPA; patient 8)。当FACS显示只有0–15%细胞阳性时结合通常是负的或+/-。有些情况下，细胞结合的FACS结果要比预期的低(CD11c, CD79a, CD95, and CD154 for patient 7)，常常反映了这些抗原的低表达。然而，抗原低表达也不总是与弱结合相关的，提示有些抗体(CD22, CD23, and CD71 for patient 8)结合细胞的能力远比其它抗体强，尽管这些强结合抗体使用时的浓度(25 or 50 mg/ml)要比其它的(200 mg/ml)低。有些点显示+/-细胞结合的，在FACS结果中却是负的(CD2, CD7, CD9, CD103, CD117, and CD122 for patient 8)，提示较小细胞亚群的检测用点阵列(106cells/array)而不是FACS(5000 cells counted)。但是这些结果应被谨慎对待，因为一个+/-结果代表了<50 cells/antibody dot，可能不是十分重要的。

  用LD array分别分析冻存及新鲜分离的正常白细胞或白血病细胞，得到可比的点阵模式。但是来自冻存细胞的一些抗体(CD9, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD56, CD57, CD79a, CD95, and CD154)偶尔会有负结果，提示可能由于这些抗原表面脱落或抗原决定簇破坏导致了结合力降低甚至丧失。根据LD array分析，尽管冻存细胞丢失了一些抗原，抗体的多功能平板也允许样品间在点阵模式上有变化，而一致模式上诊断不变。

  来自20个CLL病人的白细胞样品和来自20个正常样品相比，其点阵模式显著不同，如图4。正常和CLL的白细胞间有28个抗原差异显著（P>0.0005），以星号标出。CLL白细胞抗原表达的一致模式按细胞结合的降序排列依次为：CD44, HLA-DR, CD37, CD19, CD20, CD5, CD52, CD45RA, CD22, CD24, CD45, CD23, CD21, CD11c, sIg, and CD71。κ和λ轻链表达诠释了白血病单克隆性。能够最好区别CLL和正常外周血白细胞的抗原是CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24和CD37。此外，CLL样品对特异性结合T细胞(CD2, CD3, CD4, and CD7)和各种骨髓细胞(CD4, CD11b, CD13, CD14, CD16, CD32, CD33, CD36, CD41, CD42a, CD61, and CD64)的抗体的结合力显著减弱，反映了白血病B细胞与正常白细胞的高比值。与此相一致，部分CLL样品对细胞表面标记如CD9, CD11b, CD11c, CD25, CD38, CD45RO, CD71, CD79a, CD79b, CD80, CD122, FMC-7, 和FLT3 (CD135)等是阳性的。两个对CD23阴性。正常外周血白细胞的血小板相对较高，可通过显微镜观察抗体对CD9, CD36, CD41, CD42a, CD60, and CD61 (Fig. 3b)很容易识别出来。白血病病人的样品通常血小板较低，反映了血液中这类细胞的比例较低(Fig. 3, c–h)。
在有些样品中，GPA点揭示了RBC(Fig. 3, e and f)污染。随后又有显示，用渗透裂解法（裂解液0.15 M ammonium chloride/10 mM potassium hydrogen carbonate/ 0.1 mM EDTA）从制备的白细胞中去除RBC以后，白细胞的结合模式没有显著改变。



Fig. 1. Binding patterns of human cell lines using the LD Array. a, key to antibody identification; b, CCRF-CEM; c, Raji; d, HL-60. The numbers in the antibody key refer to antibodies against the corresponding CD antigens; mIgG1 and mIgG2a are murine isotype control antibodies; 44 v3–10 and 44 v6 are antibodies against CD44 variants 3–10 and 6; k, l, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, and sIg are antibodies against human k and l light chains, GPA (CD235a), HLA-DR, KOR-SA3544 antigen (CD66c), FMC-7, and surface immunoglobulin.



Fig. 2. Relationship between cell density of the sample and number of cells binding to antibody dots on LD Arrays. Serial 2-fold dilutions of a suspension of Raji cells (107 cells/ml) were tested on LD Arrays. The number of cells bound to antibody dots for HLA-DR (f) and CD38 (F) are plotted against the density of cell suspensions. Regression analysis of data for HLA-DR (OOO) and CD38 (——) gave coefficients of correlation (R2) of 0.97 and 0.96, respectively.





Fig. 3. Binding patterns of human leukocytes using the LD Array. The leukocyte abbreviation, source, and cell density of the sample appear in brackets. a, key to antibody identification; b,normal peripheral blood leukocytes (subject 1; 4x109 cells/liter); c, CLL (patient 1; 30x109 cells/liter); d, CLL (patient 2; 9x109/liter); e, HCL (patient 3; 16x109 cells/liter); f, mantle cell lymphoma (patient 4; 19x109 cells/liter); g, AML (patient 5; 190x109 cells/liter); h, T-cell ALL (patient 6; 17x 109 cells/liter). The numbers in the antibody key refer to antibodies against the corresponding CD antigens as defined in the legend to Fig.1.



Table 1 Comparison of LD Array and flow cytometric analyses for two CLL samples Dot array results are expressed as level of cell binding to each antibody dot: 2 (none), 1/2 (very low), 1 (low), 11 (moderate), 111 (high), 1111 (very high). Flow cytometric analysis results are expressed as percentage of cells showing fluorescence for each antigen. The (1/2) to (111) results shown in brackets denote intensity of fluorescence compared to cells with control antibody (FITC- or PE-conjugated murine IgG1).



Fig. 4. Immunophenotypes of normal peripheral blood leukocytes and CLL cells. Leukocytes from peripheral blood of 20 normal individuals and 20
CLL patients (with leukocyte counts ranging from 8x109/liter to 250x109/liter) were tested using the LD Array, and the density of cell binding was scored by comparison with a set of standard dots of increasing intensity, as shown in the inset. The average values for CLL cells were calculated for each antibody and are plotted in descending order (black bars). The average values for normal peripheral blood leukocytes are also shown (gray bars). Statistical significance (P , 0.0005) of differences between CLL and normal peripheral blood leukocytes was determined by two-sample Student’s t test assuming equal variances and is shown by an asterisk (p).



Fig. 5. Confocal microscopy. Detection of CD3 (green fluorescence) and CD19 (red fluorescence) on leukocytes from (a, b, c) a normal individual
and (d, e, f) a CLL patient (patient 9; 13 3 109cells/ liter), bound to three different antibodies on an LD Array: a and d, anti-CD5; b and e, anti-CD7;c and f, anti-CD20. White scale bar, 10 mm. The binding of fluorescently labeled CD antibodies to cells captured on an LD Array is described in “Materials and Methods.”

　

  来自CLL样品的白细胞以高密度和抗CD5相结合(Fig. 3, c and d)，与已知的CLL上CD5的表达相一致。这种结合的密度相对于CLL细胞与其它T细胞标记（如CD7）的结合密度相比是高的，而与B细胞标记（如CD20）的结合密度相当。如图5所示，与一个抗体点结合的细胞群体可通过标记可溶性抗-CD3-FITC（绿色）和抗-CD19-PE （红色），用共聚焦显微镜观察得到进一步验证。正常的结合到CD5和CD7点上的外周血白细胞很明显是T细胞(Fig. 5, a and b)，而与CD20结合的则是B细胞(Fig. 5c)。与此相比，与CD5结合的CLL细胞则是B细胞(Fig. 5d)，而在CD5和CD7上则观察到较少量的T细胞(Fig. 5, d and e)。仅有两个样品的CD20结合B细胞(Fig. 5, c and f)，在CLL病人的血液中很明显是白血病B细胞。

讨论
  LD芯片可以对许多白血病样品进行大范围的表面抗原的筛选，尤其当点阵模式的记录和分析都是自动进行时尤为突出。用LD芯片进行血癌分析时，不仅有可能识别细胞的谱系和成熟期，而且还可能发现新的预兆标记。所识别的稀有表面抗原可在化疗后检测残留的最小疾病，同时作为人为单克隆抗体免疫疗法的靶(18, 19)。

  尽管LD芯片是一个强有力的工具，它并不能提供FACS分析所得到的所有信息，如单细胞或抗原表达/细胞水平的多参数分析。尽管LD芯片允许对显著免疫表型细胞亚群的相对密度进行半定量，却不能做到绝对的完全定量。在平衡方面，由一个抗体点捕捉到的细胞数不仅取决于细胞数量，还取决于反应的亲和力、点上的抗体浓度、细胞表面抗原的表达水平，以及固定在硝酸纤维上的抗体的空间可接近性。所计算出的对点上细胞密度（pixel intensity）的定量不仅取决于细胞数，还取决于细胞的大小和形态。LD芯片的主要优点在于其速度和广泛的免疫表型，使得用大型显微抗体点阵可进行模式识别。尽管这些抗体液态时在4°C并不稳定，但LD芯片片干燥后可在4°C多保存6个月，而其结合力没有显著丧失。硝酸纤维潮湿后即变透明的本性可对结合的细胞进行显微检查。如果相对外周血白细胞的背景异质性来说，对低密度白血病的一致点阵模式的识别被证明是有问题的，则任何抗体点上的细胞亚群就能通过荧光显微镜观察。
   LD芯片现在被用于建立白血病诊断的抗原表达的一致模式，而不是慢性淋巴细胞白血病CLL。大量白血病的LD芯片结果的集合为源于血液的癌症的模式识别诊断提供了一个数据库。已有相关数据库被描述为通过流式细胞仪运用免疫组型方法对血癌进行诊断(20)。自动处理芯片，记录点阵模式、计算机定量以及模式识别等正在发展中。这些过程的标准化可以将来自不同实验室的数据集直接进行比较。还需要另外的工作来确定每个抗体的最佳浓度。当前使用的抗体的浓度适用于FACS分析使用。可以通过对不同抗体浓度和/或杂交克隆的筛选来进一步增强LD芯片的灵敏度。

  CLL要么是稳定的，要么是增殖的(21, 22)。最近的研究将稳定的疾病与低bcl-2/bax比值相关联(23)，而将增殖的疾病与高血清水平的CD23和IL-8相关联(24 –26)。然而，尝试将CLL免疫表型与疾病诊断相关联则产生了非决定性的结果(27)。LD芯片筛选大量CLL样品以作大范围CD抗原表达的能力可能会识别出新的CLL亚群。此外，对冻存白血病样品的检测可以发现免疫表型与疾病增殖之间的相互关联。在最近的Seventh Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (Harrogate, United Kingdom)，新发现的81种CD抗原被命名，最后一个是CD247。与这些CD抗原相对应的单克隆抗体将很快商业化，进一步拓展了用LD芯片分析白细胞群体的范围。