脐血干/祖细胞研究最新进展

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脐血是从脐带和胎盘采集的血，其中含有丰富的干细胞和祖细胞。干细胞是具有全部或部分分化能力和自我更新能力的细胞[1]。祖细胞是能够通过一系列细胞分裂产生特定细胞系的亲代细胞。而“造血”正是依赖造血干/祖细胞来完成源源不断的分裂、增殖和分化过程。脐血是替代骨髓进行造血细胞移植的理想的细胞来源，此外，它在基因治疗中也有很大的应用潜力。
随着人们对脐血细胞的生物学性质和临床应用潜力的认识的不断深入，以及脐血库在世界范围内的广泛建立，脐血已经成为当前生物医学研究的热点之一。特别是在最近的一、两年中，人们对脐血的研究又获得了许多新的突破。本文将就世界范围内脐血研究的最新进展作一个综述。

1. 脐血干/祖细胞的生物学性质
  人脐血中的造血细胞包括造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSC）以及成熟血细胞的直接祖先，即造血祖细胞（Hematopoietic progrenitor cells，HPC）。脐血造血细胞的主要特征有：1）能在体外长期存活；2）具有广泛的增殖能力，这可能是由于它们具有快速脱离细胞周期G0/G1期的性质；3）作为以逆转录病毒为媒介的高效基因转移的理想靶细胞[2]。
虽然不是所有的造血细胞的表面都带有CD34抗原，但是在实验研究和临床血液移植中，人们往往把CD34抗原作为为鉴定和分离人干/祖细胞的重要标志。CD34抗原是一种整合的膜糖蛋白，其分子量为90-120kD，可能与细胞间黏附及造血相关基因的表达有关。Gao等[3]将人类CD34+细胞和CD34-细胞作了比较，认为前者的NOD/SCID鼠移植潜能比后者高出100倍以上，也在一定程度上说明了以CD34抗原作为判别依据的可行性。
不同胎龄的胎儿与初生婴儿相比，脐血造血祖细胞的表型和功能有一定的差别。Wyrsch等比较了怀孕16-34周的不成熟胎儿和足月出生的婴儿的脐血，发现循环（circulating）祖细胞的频率在怀孕的4-6个月时达到最高，而随后又线性下降[4]。这表明未足月婴儿的脐血干/祖细胞具有更强的扩增能力，而在基因治疗方面也有更强的应用潜力。
端粒是所有的真核生物染色体的末端部分，富含G/C重复序列。随着细胞分裂和分化的不断进行，端粒的重复片段逐渐丢失，而其长度也逐渐变短。De Pauw等利用一种新的精确计算方法，并结合PNA FISH和数字荧光显微镜的应用，发现脐血干细胞（UCBSC）的端粒平均长度明显长于成人的骨髓干细胞（BMSC），这被认为是脐血造血增殖潜能高于骨髓的理论依据之一[5]。
造血干/祖细胞的生长是由造血细胞因子来调控的。各种造血因子几乎都是多效性的，它们对不同细胞行使不同功能。这种功能上的显著不同依赖于不同的靶细胞，不同的因子浓度以及不同细胞因子的相互作用。在体外培养中细胞因子的加入可能会很大程度地改变细胞的原始表型。Porretti等[6]从两份脐血中分离纯化CD34+细胞后在加有IL-6，IL-11，FL和血小板生成素（TPO）的无血清培养基扩增培养两周后，发现培养细胞的免疫表型发生了显著的改变（表1）。这提示上述细胞因子组合具有促进CD34+细胞分化成熟的作用。

表1 CD34+细胞体外扩增两周的免疫表型变化[6]

细胞表型
第一份脐血
第二份脐血

起始
两周后
起始
两周后

CD34+
71
10
85
19

CD34+/38-/33-
1.2
0.4
0.1
6

CD34+/38-/33+
21.5
8.3
<0.1
66

CD34+/38+/33-
69.2
90.8
64.5
25.4

CD34+/38-/W90+
2.7
0.14
0.1
1

CD34+/33+/13+
45
97
43
95

2. 脐血的体外扩增
  根据Patricia等[7]的定义,细胞增殖（proliferation）是指从某一特定的细胞群产生新细胞的过程，而不管产生的细胞的类型；细胞扩增（expansion）是指产生更多保持起始细胞群的特定特征的细胞；细胞分化（differentiation）是指形态上可以识别的细胞祖先产生下代细胞，以及特定造血系产生成熟细胞（图1）

增殖
分化


增殖
维持
分化

增殖
扩增
分化



                 图1 造血干/祖细胞体外生长示意图[7]
A.起始细胞群能产生新细胞，因此总细胞数量增加（增殖）。产生的细胞表现出了不同造血系的成熟特征（分化）。然而保持起始细胞特征的细胞数量却减少了。B.起始细胞群增殖和分化，保持起始细胞特征的细胞数量不变。C.起始细胞群增殖和分化，保持起始细胞特征的细胞数量增加（扩增）。
通常认为，单份脐血的干细胞量只能满足体重不大于30kg的儿童，成人应用因数量不足而受到限制。 根据Gluckman等人的研究，脐血移植中有核细胞的剂量至关重要。据报道，高有核细胞剂量对嗜中性粒细胞植入有促进效应，且有核细胞剂量>3.7×107/kg是预测良好生存的因素之一[8]。鉴于人脐血干/祖细胞在临床上的重要意义，一些研究小组致力于探索出这些细胞体外扩增的理想条件。
  研究表明，CD34+细胞的扩增能力除了与胎儿的孕期有关以外，还与不同的细胞周期有关。Summers等[9]研究了分别处于细胞周期的G1和G0期的脐血CD34+细胞的扩增的质量和数量。他们将细胞培养在无血清无基质细胞、但添加有SCF，FL-3，TPO的培养基中，通过流式细胞仪计算每周收获的细胞数，发现培养的G0期细胞不但产生更多的CD34+细胞，而且G1细胞群的后裔中表达CD34抗原的细胞比例比G0细胞群下降地快得多。其结论是G0期的脐血CD34+细胞比G1期的细胞在体外产生祖细胞的能力高1000倍。
  在培养基中添加胎牛血清是维持和扩增干细胞的常用方法之一， 但是血清中可能存在一些过敏原或感染因子， 如牛海绵状脑炎或其他朊病毒疾病等。Lazzari[10]等在使用相同的细胞因子组合的条件下比较了三种无血清培养基，发现培养基StemPro 34 SFM（Life Tech- nologies）和CellGro SCGM （CellGenix）扩增有核细胞的能力比培养基X-Vivo 10，（BioWhit- taker）高4倍以上，而扩增CD34+细胞的能力分别高出5倍和7倍以上。Gilmore等[11]发现无血清培养基QBSF-60的使用可以使CD34+细胞扩增4倍左右。如果要扩增出供成人移植的足够的干细胞，这种培养基中的细胞快速扩增可以显著减少所使用的扩增培养基的总量。该条件下细胞扩增的机制仍不清楚，有可能是因为血清的FCS中可能包括造血移植因子或分化因子，从而削减了CD34+细胞的数量。对于细胞生长环境中可能存在的造血抑制因子，一些研究者采用添加抗体的方法，也有报道在培养基中添加使用不同的基质细胞株。
  美国血液学协会迈阿密会议上，报道了若干描述使用Aastrom细胞生产系统的CB和PBP C的体外扩增。Kurtzberg和同事描述了被移植入21个病人的CB产品的扩增。每个病人在第0天接受了未经处理的CB 细胞和在第12天接受了扩增的细胞。在这些病人中没有观察到移植动力学的显著的效应。Stiff等也报导了Aastrom系统扩增CB细胞及为9个病人进行的移植。病人体重的中数是74kg，范围是47～117kg。嗜中性粒细胞的植入时间中数是26天，范围是14～36天。在这些病人中血小板的植入被推迟。作者得出结论，体外扩增的CB细胞对在其它条件下不可治愈的血液疾病成人患者可能有用[8]。Mandalam等利用AastromReplicell细胞生产系统，发现通过频繁地交换培养基也可以获得脐血干/祖细胞的扩增[12]。
  至今为止绝大多数的实验条件都是以使用重组细胞因子为基础的。Guzmán等认为，在CD34+细胞占总细胞的50%以上时，通过细胞因子的理想组合可以获得造血细胞的显著增殖和扩增[7]。许多研究者都认为使用早期作用细胞因子（early acting cyto- kines），如FL（FLT-3配体）和TPO（血小板生成素），对脐血干/祖细胞的体外扩增有很重要的影响。使用含有FL和TPO的培养基，Shadduck实验室获得了CD34+细胞20-30倍的扩增。再加入干细胞因子和IL-6到培养系统后，4-6周的体外培养可以获得CD34+细胞100倍的扩增[13]。Yamaguchi等将脐血CD34+细胞放在加有血小板生成素（TPO）、FLT3/FLT2配体（FL）和干细胞因子（SCF）的、但不含血清的单层人原始骨髓基质细胞上培养。培养2和4周以后，CD34+细胞和克隆形成单位分别扩增了100和1000倍以上，而卵石区域形成细胞也分别扩增了18和60倍。严重并发免疫缺陷紊乱（severe combined immunodeficient disorder，SCID）的小鼠的重建细胞（SRC）分析表明了培养扩增细胞的植入有效性。在可以从干细胞捐献者或者其受体获得基质细胞的临床条件下，体外扩增系统具有显著的应用价值[14]。
虽然在细胞扩增方面已经取得了一定的进展，但是控制细胞增殖、扩增、分化的机制至今仍不很清楚。


3. 脐血库的建立和脐血干细胞移植的临床研究
  脐血移植的最佳方案之一是利用经胚胎选择的新生儿的脐血来治疗其兄弟姐妹的疾病。该技术于2000年8月在美国首次应用于临床：为一个患有范尼可贫血的6岁女孩莫利“创造”了一个弟弟，用他的脐血为莫利进行成功的移植。而英国也在日前批准了为一个三岁的地中海贫血患儿人工选择胚胎，以进行下一步脐血移植[15]。
  脐血移植除了适合于相关供体移植以外，在无关供体移植方面也有令人瞩目的应用潜力。Hirose等的研究表明，脐血中的B细胞的IgH的N端明显短于外周血B细胞，IgH基因几乎没有重排，而且B细胞分化相关基因之一的末端转脱氧核苷酰酶（TdT）不表达，这些都表明来自脐血的B细胞更不成熟[16]。由于脐血细胞独特的免疫学特性，在移植中最具临床相关性的HLA的6等位基因只要匹配5种甚至3种即可使用，而脐血移植后发生移植物抗宿主病（GVHD）的可能性又要低于骨髓和外周血。
  脐血的进一步开发和利用必须要求有一个可以随时获得的、安全可靠的脐血干细胞来源。1992年美国Arizona大学建立了世界上最早的脐血库之一， 1994年脐血库便向公众开放。至1998年12月仅纽约、Dusseldof、Milan三个主要的脐血库已冻存一万份以上的可供移植的无关供体的脐血，从而使接受脐血移植的患者与日俱增。而根据2000年初的统计，脐血库已经储备了超过30000份的脐血，实施的儿童脐血移植超过1500例，而应用于成人恶/良性疾病的治疗的脐血移植也逐年增加。特别值得注意的是，无关供体脐血移植在近几年迅速发展，并且已经占了总移植数量的绝大多数（图2）[17]。




        图2 欧洲脐血登记处统计的每年无关/相关脐血移植的数量[17]

  根据欧洲脐血登记处2000年的统计数据，在来自29个国家121个移植中心的527例脐血移植中，138例的供体有亲缘关系，而399例无亲缘关系。结果表明脐血移植的存活率与骨髓移植相近。而急性或慢性的移植物抗宿主病的发病率在脐血移植中却有明显的减少，甚至是在HLA不匹配的情况下也是如此[17]。而就骨髓移植来说，HLA必须严格匹配。当开始寻找适合的供体到移植实施，5%患者的等待期在2个月以内，50%患者的等待期在4个月以内，而95%患者的等待期在16个月内。这使相当一部分可以获益于骨髓移植的病人在等待合适供体的过程中死亡。成功的配型在少数人种中则更加困难[18]。
  虽然HLA匹配的兄弟姐妹作为供体时的骨髓移植比使用非相关的脐血移植具有更好的临床效果[19]，但是在没有合适供体的情况下，脐血移植是一个很好的选择。Ooi等报道，7个患脊髓发育不良综合症（MDS）相关的二级急性白血病患者在接受HLA不匹配的脐血移植后，五人存活并在7-31个月内无疾病[20]。39个患有恶性血液病的儿童在移植了无关供体的脐血后，预计的三年无风险存活率为49.2-16.6%[21]。相信随着临床经验的不断积累，脐血移植将会为更多血液或免疫疾病患者带来福音。

4. 脐血在基因治疗中的潜在应用
  基因治疗是将外源基因转入靶细胞，通过在患者体内表达，纠正或治疗疾病的过程。脐血干/祖细胞具有很强的自我更新能力和增殖能力，因此是外源基因导入的理想受体。虽然转基因的方法很多，但是将目的基因导入脐血干/祖细胞的最主要方法是逆转录病毒导入法。因为脐血干细胞能分泌生长因子，且它们更多处于细胞周期中，这对于采用逆转录病毒载体介导基因转移至关重要：逆转录病毒载体只能介导处于增殖、分裂中的细胞进行基因转移。
  在脐血移植后的免疫重建中，使用基因修饰的树突状细胞（dendritic cells，DCs）在免疫治疗中会成为一种预防感染和复发的有效途径[22]。在HIV感染的治疗方面，也可以利用多种以脐血细胞为受体的基因治疗方法，如转导“保护”基因进入脐血细胞，使其在HIV敏感的靶细胞上表达，特别是CD34+淋巴细胞。Wang等[23]也成功地将耐药基因MGMT和MDR1利用逆转录病毒载体转入人脐血CD34+细胞中，这两种基因的共表达使耐药性能分别提高了5.8-6.3倍和5倍。这为临床上改善病人在化疗过程中的综合耐药性能提供了实验基础。
  造血干细胞的转基因和自体移植来治疗遗传性血液疾病和免疫缺陷的最大优势在于，这种疗法在提供与异源移植相同益处的同时，能避免可能伴随的免疫并发症。但是由于相当一部分脐血早期祖细胞处于休止期，外源基因转入率较低，这给成功的基因治疗带来了最大的阻碍。一次最近的临床试验报道了利用转基因技术治疗X-连锁严重并发免疫缺陷的婴儿，由于基因修正的淋巴球的选择性生长使免疫系统获得重建[24]。Moore研究小组在最佳条件下扩增脐血CD34+细胞后，使用DHFR（dihydrofolate reductase）转基因，40%的细胞成功地进行了逆转录病毒转导[25]。相信处理造血细胞的更新的方法能获得转基因和临床治疗的更高效率。

5. 小结和展望
  脐带血作为一个新的干细胞资源而倍受关注，已经显示出了诱人的应用前景。研究者们在该领域进行了广泛而深入的研究，并取得了一定的成果。现在有待解决的问题主要有：（1）UCBSC的扩增和分化之间的矛盾；（2）UCBSC体外长期培养后其植入能力的改变；（3）UCBSC接受者的长期耐受；（4）具有临床应用价值的细胞类型的最佳有效扩增条件。
  人们乐观地相信，随着脐血从采集、分离、基因转移到体外扩增等技术上的进步，操作程序的不断规范与完善，脐血库以及脐血联网在世界范围内的广泛建立与开通，脐血干细胞移植一定会在不远的将来在临床得到更加广泛的应用。