检测细胞凋亡的实验方法比较

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◆ TUNEL 与 ELISA 检测凋亡的方法比较
TUNEL法
　　细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.

ELISA法测细胞凋亡
细胞凋亡时，Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡合苷酸小体，各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。

◆ 几种检测凋亡的方法
一、形态学观察方法
1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
二、DNA凝胶电泳
（一）、检测原理
细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
（二）结果判断
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
（一）检测步骤
1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；
2、在微定量板上吸附组蛋白体’
3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
4、加酶的底物，测光吸收制。
（二）用途
该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
四、流式细胞仪定量分析
（一）检测原理
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
（二）应用价值
流式细胞仪检测具有以下特点：
1)、检测的细胞数量螅?虼似浞从橙禾逑赴?牡蛲鲎刺?冉献既?BR>2)、可以做许多相关性分析
3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。
■DNA片断原位标记法
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种：
1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT)技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3·－OH端
2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。
■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法
1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。
3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

◆ 几点参考
1.大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体等，DNA电泳也不见得都有DNA ladder，但对某些指标来说还算稳定，如PI染色及TUNEL法，所以如果某个方法效果不好，可以换用其他方法检测
2.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统认识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大程度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话，强行区分是没有意义的

◆细胞凋亡检测技术与方法
细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法（概括如图1）：
1． 早期检测:
1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测:
PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。
美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

2）细胞内氧化还原状态改变的检测：
这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monochlorobimane(MC 体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。
正常状态下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物
细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。

4) 线粒体膜电位变化的检测：
在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

2． 晚期检测：
细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：
1） TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。

2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)
当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert甃M-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated PCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

3) Telemerase Detection (端粒酶检测)
这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通
过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.
同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。

3．mRNA水平的检测
研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X (长的) 作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。Intergen公司的Amplifluor™ Apoptosis Gene Systems就根据这一新技术原理，通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法，随着凋亡机制研究的深入，近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等，Cell Signeling technology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem & Oncogene公司都紧跟科研潮流，开发了大量的抗体及活性测定产品。

随着对细胞凋亡的研究和认识的不断深入，对包括肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要。目前，多种方法已得到较广泛的应用。然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出正确的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题。本文简要评述几种常用的细胞凋亡检测方法。

◆
一、 细胞凋亡的形态学观察
细胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。
光学显微镜观察
凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之一。

检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。

视频时差显微技术（video time-lapse microscopy）
本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。

检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影。

电子显微镜观察
关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象。一些不典型的改变容易被忽略，在观察时要特别予以注意。

检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

流式细胞技术
流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。
细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。

检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。

二、细胞凋亡的细胞化学测定

细胞凋亡的细胞化学测定包括细胞表面（细胞膜）的结构和通透性改变的测定和细胞核DNA改变的测定。根据应用的范围，又可分为细胞群休和单个细胞测定两种，以下仅介绍其中几种较为常用的方法。

碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测
早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI)不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色最强。早期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。坏死细胞红色荧光最强。

膜联蛋白（annexin）V标记
正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其原因尚不明。同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。

检测方法：1×106细胞/ml细胞悬液，先后用膜联蛋白V--FITC及PI染色，流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（cytogram），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数在所点的组份表早期凋亡细胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+）,左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+）。用生物素标记膜联蛋白V还可以作体内试验。将生物素标记膜联蛋白V注射小鼠体内，30分钟后处死，迅速取出要研究的组织置于甲醛内固定，然后，常规石蜡切片，脱蜡、水化，用亲和素标记的过氧化物酶程程序孵育，DAB显色，光镜下观察凋亡细胞。

DNA琼脂凝胶电泳法
细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，DNA在核小体间被切割成180-200bp整数倍的单或寡核苷酸片段，在电泳时表现为特征性的“梯形带”。自Wyllie把内源性核酸内切酶降解产生“梯形带”与细胞凋亡相联系以来，“梯形带”被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标。尽管有报道指出，实验中出现典型的形态改变时可不伴有核小体间的DNA降解，对这一指标提出质疑，本方法仍被广泛应用。但此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。

检测方法：培养细胞清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已锭的1％-2％的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，最后在紫外线灯下观察和摄影。
DNA裂解的原位检测
在细胞水平检测DNA裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞，细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的继裂（缺口，nick）。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸在3`-OH端予以显示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脱氧核苷酸转移酶（TdT），前者使核苷酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为“原位缺口平移”(insitu nick translation,ISNT),后者使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在，其方法被称为未端记（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的应用已很广泛，其优点是可用于原位标记，可用于病理组织，并可进行定量分析。值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现 阳性反应。组织或细胞外理不当时可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的。而不是特异性的，TUNEL或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，除外非凋亡的阳性反应。

检测方法：石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，显色（辣根过氧化物酶标记可用DAB显色，碱性磷酸酶标可用NBT+BCIP显色），复染，脱水，封片。凋亡细胞核呈现蓝色（NBT+BCIP显色）或者棕黄色（DAB显色）。

凋亡蛋白质酶（Caspase）-3及其底物的检测

凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸（Asp）残七C端肽键功能，是近年随着调亡研究的深入而发现的重要凋亡分子。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1-13。基中凋亡蛋白质-3是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子。活化的凋亡蛋白质酶-3仅在凋亡细胞中发现，因此，检测凋亡蛋白质酶-3的活性有助于发现早期的凋亡细胞。一般采用人工合成四肽荧光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白质酶-3在D与AMC之间水解，释放荧光物质、AMC，后者在紫外线激发下发出波长为430-460nm的荧光，通过流式细胞仪或分光光度计对其强度进行定量，从而测定凋亡蛋白质酶-3的活性。由于醛对凋亡蛋白质酶-3的水解活性抑制作用，因此同时加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白质酶-3对DEVD-AMC的水解，不产生荧光。这样的抑制试验可作为对照，使凋亡蛋白质酶-3的活性分析更有特异性。但是，上述方法不适用于组只切片，因此有人尝试采用针对活化的凋亡蛋白质酶-3亚基的抗体，通过免疫组化显示凋亡细胞，然而其敏感性及特异性尚不能令人满意。

检测方法：培养细胞（也可以预先作凋亡诱导并在不同时段收集细胞）在裂解液内裂解、离心、去上清液。加入凋亡蛋白质酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同时用不加底物的样品作对照，流式细胞仪检测，加有底物的样品释放出的荧光强度样对照样品明显增强。如加入DEVD-AMC时再加入DEVD-CHO，样品释放的荧光强度与对照样品无差异。

凋亡蛋白质酶-3导致细胞凋亡是通过水解或灭活一些细胞关键蛋白质实现的，因此检测凋亡蛋白质酶-3底物的改变也有助于辨认细胞的凋亡。PARP是第一个被认识的凋亡蛋白质酶-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000及相对分子质量为25000的两个片段，用运载相对分子质量为85000片段的抗体可以观察细胞是否发生凋亡。细胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白质酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸残基形成一个新的抗原表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认凋亡细胞。另外一种细胞骨架蛋白质肌动蛋白（actin）被水解后产生一种称为“fractin”的片段，在凋亡早期出现，并认为与细胞膜的起泡有关，可能有助于早期凋亡细胞的辨认。总之，随着对凋亡蛋白质酶及其底物的进一步研究，将会发现更有价值的有助于检测凋亡细胞的方法。

三、展望

除了以上介绍的几种较常用检测细胞凋亡的方尖，还有一些尚未被列入的检测方法，新的方法正将出现。尽管用于检测细胞凋亡的方法较多，但形态学观察，尤其是透射电镜观察仍具有不可替代的作用，只是其应用受到一定限制。在细胞化学检测方法中，迄今没有任何一种方法具有足够的敏感性和特异性，尤其在病理组织中要作出准确定量分析仍较为因难。在目前情况下标本和病变的特点，选择多种适当的方法进行综合检测，常可行到较准确结果，同样重要的是，要充分理解各种方法的原理及应范围，并对结果作出合理的分析和判断。随着对细胞凋亡认识的深化和有关技术的进展，期待更敏感、更特异的方法面世，这对于病理状态（包括肿瘤）中细胞凋亡的研究将具有重要意义。

◆ 有关细胞爬片
1. 处理细胞爬片：用灭菌的去离子水将多聚赖氨酸配成0.1mg/ml,处理载玻片过夜即可。用前再用去离子水漂洗一次，就可直接接种细胞！

2. 热疗对细胞内热休克蛋白70的诱导
陈必良1，安晓汾2，辛晓燕1，王德堂1，郭慧玲1（1第四军医大学西京医院妇产科，
陕西西安 710032；2第四军医大学吉林军医学院附属医院妇产科，吉林省 吉林市，132011）
　【摘要】目的 探讨肿瘤细胞（以人卵巢癌细胞为例）在受热不同时间、不同间隔后细胞内热休克蛋白70表达的异同；明确人卵巢癌细胞对热耐受的敏感程度。方法 体外培养人卵巢癌细胞HO-8910，制成细胞爬片。加热温度设为42℃，实验分成两部分：①加热时间分别设为15、30、60、90、120、150min，加热后立即固定细胞；②将细胞加热120 min后，置于37℃细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后1h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h后的细胞爬片固定。然后将两组细胞爬片行HSP70的免疫组化染色，观察热疗前后HSP70的不同表达。结果 未加热细胞仅有少量HSP70的表达，随加热时间延长，HSP70的表达逐渐增多；加热后不同间隔HSP70的表达不同，间隔6 h HSP70的表达最强，随后逐渐减少，5-6天后，恢复至未加热状态。结论 ①温和加热时间过长可诱导HSP70的大量产生，从而使肿瘤细胞对热疗产生热耐受作用; ②卵巢癌HO-8910细胞对加热有较强的耐受性。
　　关键词：热休克蛋白70；免疫组织化学；热耐受；卵巢癌；
随着科学技术和医学科学的发展，对癌症的诊断和治疗有了长足的进步。高温治疗也称热疗（hyperthermia，HT，又叫温热疗法）,以其无手术痛苦、无术后并发症及无化疗及放疗带来的副反应而发展成为癌症治疗的有一种有效方法[1]。高温可导致肿瘤细胞死亡或者生长抑制，同时高温还可提高肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，因为肿瘤细胞对于高温的敏感性明显高于正常细胞。但在应用过程中也发现，随热疗重复次数的增加，热疗效果反而下降，会出现所谓“热耐受（thermotolerance）”现象，即第1次加温可影响第2次加温的生物学效应。这说明在热疗过程中，肿瘤细胞内生成了某些物质可降低其对热的敏感性。研究表明[2]，该现象与热休克蛋白家族尤其与热休克蛋白70（HSP70）的关系密切。本研究利用人卵巢癌细胞HO-8910受热后进行HSP70免疫组化染色，以了解在该细胞中HSP70的表达与加热之间的关系。
1 材料和方法
　　1.1 材料 人卵巢癌细胞系HO-8910为分化差的卵巢浆液性囊腺癌细胞，由第四军医大学西京医院实验室提供。HSP70成套免疫组化试剂盒（产品编号 SA2077）及DAB显色试剂盒（产品编号 ED1022）均购自武汉博士德生物工程有限公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 加热处理 将细胞接种于含热灭活的15%小牛血清及双抗的RPMI1640 (Gibco BRL,USA) 培养液中，常规培养。取对数生长期的细胞，经0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，细胞密度为1×105/ml。将1cm×1cm 大小的盖玻片置于24孔板中 ，每孔加入1ml的细胞悬液，制成细胞爬片。12 h后，将24孔板置于42℃培养箱中分别进行两种实验处理：①加热时间分别设6个时间点，即15、30、60、90、120和150 min，加热后的细胞即刻用0.01M PBS洗涤2次 ，用4%多聚甲醛固定细胞40 min，制成细胞爬片后置于4℃冰箱中保存备用；②将细胞加热120 min后，置于37℃细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后1、4、6、12、24、48、72、96、120及144 h后的细胞爬片按照上述步骤处理细胞固定后备用 。
　　1.2.2 HSP70表达的免疫组化染色检测 将细胞爬片置于3% H2O2中室温孵育10 min，以蒸馏水洗涤后次滴加正常山羊血清封闭液室温放置20 min、滴加小鼠抗HSP70的抗体37℃ 1 h、滴加二抗及试剂SABC室温下各放置20 min，最后以 DAB显色, 染色时间统一设为5 min后终止。再经 苏木素轻度复染、常规脱水、透明和封片后，于显微镜下观察并照相。阳性细胞胞浆/胞核染成棕黄色。
　　1.2.3 统计学处理 采用等级资料的秩和检验
2 结 果
　　① 在42℃条件下，加热不同时间，卵巢癌细胞HO-8910细胞内HSP70的表达见表1。未加热的细胞内(见图1A), 有少量的HSP70表达，表现为胞浆内有极淡的淡黄染色；当42℃加温15 min时，细胞内HSP70的表达与正常细胞相比较无明显改变；加热30 min后 (见图1 ，可见胞浆内HSP70的染色略增强，但颜色仍较淡，仅限于胞浆，但胞浆染色数量增加；无胞核染色；加温60 min时(见图1C)，可见胞浆内HSP70的表达增强，表现为胞浆染色加深呈深黄色，染色细胞接近100%，但未见核染色；加温90 min时(见图1D)，胞浆内染色进一步加强呈棕黄色，偶尔可见核染色；加温120 min时(见图1E)，胞浆内染色表现为明显的棕黄色，核染色的细胞增多；加温150 min时(见图1F)，胞浆内呈深棕黄色，核染色细胞数进一步增多。
表1 HO-8910细胞温和加热不同时间的免疫组化染色
　　组别 例数 染色分级 胞浆染色的细胞数 核染色的细胞数
　　第一组 10 Ⅰ（淡黄色） 40%～50% 0
　　第二组 15 Ⅰ（淡黄色） 40%～50% 0
　　第三组 20 Ⅰ（淡黄色） 80%～90% 0
　　第四组 20 Ⅱ（深黄色） 100% 0
　　第五组 20 Ⅲ（棕黄色） 100% 5%
　　第六组 20 Ⅲ（棕黄色） 100% 10%～15%
　　第七组 20 Ⅳ（深棕黄色） 100% 20%～30%
※ P<0.05
注：①第一组为未加热细胞；第二组为42℃加热15 min；第三组为42℃加热30 min；第四组为42℃加热60 min；第五组为42℃加热90min；第六组为42℃加热120min；第七组为42℃加热120min
②免疫组化细胞染色分级标准——淡黄色Ⅰ级；深黄色Ⅱ级；棕黄色Ⅲ级；深棕黄色Ⅳ级
② HO-8910细胞加热120 min后，间隔不同时间进行免疫组化染色，结果表明, 加热后1 h，细胞染色呈深棕黄色仍保持强阳性（Ⅳ级），未见明显淡化；加热后4 h（见图2A），在所有染色的细胞爬片中，细胞染色表现为最强Ⅳ级，核染色的细胞约占50%；加热后6 h，几淡化呈Ⅲ级棕黄色，但核染色未见明显减少(见图2 ；加热后24 h，染色程度呈Ⅲ级，染色细胞数量仍保持100%，但胞核染色明显减少，(见图2C)；加热后48 h，核染色全部消失，胞浆染色明显变淡呈Ⅱ级深黄色(见图2D)；72 h后，HSP70的表达进一步减少，细胞染色呈黄色（图 2E），随后，细胞染色每隔24 h即有明显淡化趋势，120 h后，细胞恢复至正常状态。
3 讨 论
　　肿瘤热疗学是近20年来迅速发展起来的一门新兴学科，为肿瘤患者的治疗带来了一线生机[3]。在临床应用过程中，发现肿瘤细胞可出现对热的耐受现象，尤其是当加热温度低于43℃（温和热疗）或加热时间过长时，更易发生热耐受[4]。热耐受不是细胞固有的特性、不遗传，是一种暂时现象，可能是热疗过程中肿瘤细胞产生的某些物质降低了其对热的敏感性。研究表明，肿瘤细胞在热应激发生后，最根本的变化是蛋白质谱的改变，表现为合成了一组特殊的高度保守的蛋白质——HSP或称为应激蛋白[5]，而正常蛋白质合成却被抑制。HSP是高热诱导的一种适应性蛋白，属于一种分子伴侣，主要功能在于当细胞处于应激状态时，可纠正新合成蛋白质的折叠和空间构象错误，协助转运蛋白质，抵抗应激原引起的变性，维持生理平衡，从而降低高热诱导的细胞凋亡[6]。HSP70在HSP家族的众多成员中,是最出色的热耐受预测因子[7]。加热过程中，伴随HSP70水平的升高，正常蛋白质的合成受到不同程度的抑制。加温后半小时无蛋白质的合成，随着HSP70的产生，蛋白质的生物合成逐渐恢复，肿瘤细胞的自我保护机制开始启动，从而引起肿瘤细胞对热的敏感性下降。
卵巢癌是威胁女性健康的生殖器三大恶性肿瘤之一，死亡率高，5年生存率不到50%。由于耐药及抵抗放疗效果的肿瘤细胞出现，为卵巢癌的治疗带来了新问题。随着热疗学理论的日趋成熟，已有研究将其应用于卵巢癌的临床治疗[8]。为了更好的将这一理论应用于临床，有必要了解卵巢癌细胞对热疗的敏感性。
本实验结果表明：① 人卵巢癌细胞HO-8910在未加热状态下，即有少量的HSP70表达，当给予温和加热（即加热温度为42℃）时，短时间内，诱导产生的HSP70未见明显增加。加热时间≥60 min后，尤其是加热时间超过120 min后，HSP70的表达明显增加，表现为随加热时间的延长而胞浆的染色加深，而且核染色阳性的细胞数量明显增多，这一结果表明细胞的热耐受已启动。②当细胞受热120 min后，停止加热，在最初的几个小时内（1～4 h），HSP70的表达保持加热当时的水平，4 h后，HSP70的生成达高峰，表现为染色程度最强，核染色细胞数量最多，说明此时细胞对热的敏感性最差。如再次加热，高温对该细胞的细胞毒作用最低。此后，随着时间的推移，HSP70的表达明显减少，5～6 d后恢复至正常水平。从实验结果还可看出，卵巢癌细胞HO-8910 对HSP70的表达有一定的时间依赖性，这也是临床上肿瘤热疗间隔需3～4 d的原因之一。此外，虽然可通过提高加热温度来减少HSP70的表达，但毕竟39℃～42℃的温度对于人体来说是能够承受的温度，因而，可考虑通过抑制热疗过程中HSP的生成而提高热疗的效率，国外已有相关的文献报道[9]。
　　一般而言，肿瘤细胞受热温度偏低，时间越长，越易形成热耐受[10]。人卵巢癌细胞HO-8910细胞在受热60 min后，就已有明显的HSP70的表达，而该细胞的恢复过程时间却长达5～6 d，这就提示我们肿瘤细胞对加热有一定程度的耐受性，而且热耐受因细胞不同而有不同的表现[11]，因此，在临床应用过程中需要考虑到这一要素。