RNAi (RNA interference )即RNA干扰,是1998年由Fire首次发现并命名的转录后水平的基因静默,是美国《Science》和《Nature》评出的2002年度最重要的科技成果之一,正成为基因功能研究和基因治疗研究的热点. 1995年,康奈尔大学的Guo和Kemphues et al [1]利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(sense RNA)相反的结果,但最终的结果却令他们费解:二者同样阻断了par-1基因的表达途径. 直到1998年,Fire et al [2]的研究证明,在正义RNA也阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA. 这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的. 这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNA interference,RNAi). 随后的研究发现,RNAi现象在多种生物中存在,如线虫,果蝇,斑马鱼,真菌以及植物等. 生物体可利用RNAi来抵御病毒的感染,阻断转座子的作用[3].
到1999年Tuschl et al [4]报道在哺乳动物中也存在RNAi,只是导入的RNA是小干扰RNA (siRNA); 2001年Berstein et al提出: 只有22核苷酸(nt,nucleotide)才能特异性地阻断dsRNA,同时他们还发现了体内一个分解dsRNA为siRNA的叫Dicer的酶[5]. 近几年来RNAi的研究取得了很大进展,他被《Science》杂志评为2001年的十大科学成就之一. 2002年RNAi的研究又有了新的突破,发现他在基因表达调控中发挥重要作用,他也名列2002年《Science》杂志评的十大科学成就之首.
2.1 Billy et al [7]的研究表明: 在小鼠的胚胎细胞中也存在RNAi . 将727个碱基对的双链RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞,诱发了细胞内的RNAi机制,并抑制了报告基因的表达. 但大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后,会非特异的阻断基因的表达. 因为长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后,细胞内的病毒防御机制被激活; 且RNA酶L(RNase L)被激活,产生非特异的mRNA降解. 而未分化的胚胎细胞中,上述防御病毒的机制存在缺陷,因而双链RNA能特异的阻断基因的表达. 但Tuschl et al [8]人的研究克服了这一障碍,他们发现,21个核苷酸的双链RNA能够诱发哺乳动物细胞内的RNAi机制,同时不会激活细胞内的干扰素. 他们合成了以荧光素酶的mRNA为靶分子的21个核苷酸的双链RNA,将他和荧光素酶的表达质粒用脂质体共转染到NIH3T3,COS-7,Hela S3,293细胞中,报告基因的表达被抑制了90%. 由于报告基因得到的结果不能完全说明细胞内的情况,他们又合成了细胞内源性基因laminA/C为靶目标的双链RNA,这个双链RNA也特异的抑制了laminA/C的表达,抑制率达到90%以上.
2.2 双链RNA的构建 双链RNA可先在体外构建好,用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差,转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体,再将载体转到细胞内合成出双链RNA,不但能增加有效转染细胞的种类,而且在长期稳定表达载体的细胞株中,双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体,使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列,当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时,他指导的转录就会终止,且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来,因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别,合成出RNA. Sui et al [9]用Bluescript作为载体,RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子,从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1),将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列,并在其后加了5个胸腺嘧啶,称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面,将载体转移到细胞中后,转录出的RNA由于具有回文序列,会形成一个发卡样结构,从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶,RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后,会在3’端形成2个突出的尿嘧啶,这类似于天然的siRNA,因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列,将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA[10]. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结,回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断,接到pGEMTeasy载体上,就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA,或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下,还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中,以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶[11]. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al [12]用腺病毒做载体,在体内和体外表达dsRNA,并成功的阻断了基因的表达.