流式细胞术在血小板活化的应用

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流式细胞术分析血小板 血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。 流式细胞仪血小板分析应用范围
通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性
通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷
结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板
发现血小板抗体，做定性和定量分析

血小板分析的临床应用
血小板活化导致的血栓前综合症：如糖尿病、非免疫性血小板活化
血管缺陷导致的血小板活化：如动脉粥样硬化、急性心梗、血管成型术、心脏移植
血小板糖蛋白的基因缺失，或血小板存储缺陷导致的出血性疾病
骨髓异常增生或骨髓发育不良、肾衰末期、血小板输血或药物副作用引起的血小板止血功能障碍
血小板相关的抗凝治疗的诊断监测
由特发性血小板减少或药物引发的血小板减少、恶性肿瘤骨髓转移导致的血小板生成减少
免疫性血小板减少、先兆子痫或脓毒症造成的血小板生成增加；生长因子治疗的骨髓反应状况监测
自身免疫和同种免疫造成的血小板减少症

流式细胞仪检测全血中血小板功能状态
全血中血小板更接近生理状态
操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变（如血小板活化试验）
同时检测血小板的多个标志物，结合FSC和SSC，评估多个参数，进行定量分析
多采用血小板特异抗体CD41或CD61画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰
检测血小板亚群灵敏度高
用血量少
无放射性污染 全血样本的制备
1. 抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程；做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化,现在最新的防止活化的方法是采用BD公司的CTAD真空采血抗凝管。
2. Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟
3. 1%多聚甲醛固定样本
4. 上机检测 质控标本
阴性对照（Isotype Control）：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差
血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控；使用正常人未活化标本作为阴性质控
血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控；使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控
血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照

血小板标本上机检测
仪器校正：由于试验室环境波动，会导致荧光有所波动，因此，需要对仪器进行校正。配置CaliBRITE微球，使用FACSComp自动校正仪器
打开CELLQuest软件，调整数据获取条件：散射光和荧光均使用对数放大。调整散射光电压，使血小板群位于点图中间位置。调整荧光电压，是对照管非特异荧光位于坐下角。使用微球或样本调整补偿
数据获取：获取血小板5000个以上。
数据分析：
1. 设门：
1) FSC-SSC点图中找出血小板，缺点是血小板较小，不易通过大小将碎片或杂质完全分开

2) 从CD41或CD61-SSC点图中画出血小板门，由于特异性高，可以有效地去除碎片和杂质的干扰。
3) 巨血小板症的病人CD42a/CD42b缺失，与正常人做对照，判断抗原缺失情况。若采用FSC-SSC设门，则正常人阳性对照的CD42a直方图中会有少量阴性细胞，这些阴性细胞主要是门内含有的碎片和杂质，诊断时应考虑这些背景干扰，如果阴性百分含量过高，就会影响诊断结果。如果采用CD41-SSC设门，就可以有效去除杂质干扰，正常人的CD42a直方图表现为只有一个阳性峰。
2． 确定阳性细胞百分率：由阴性对照相应的直方图或点图确定阴性界值，由样本管确定阳性百分率
3． 分析细胞抗体结合量：使用QuantiBRITE系统，检测血小板上结合的抗体含量。适合应用在血小板活化试验中 附1：巨血小板症的流式细胞分析 l 分析血小板的CD42a/CD42b。

准备阴性对照管、阳性对照管和试验管，进行染色：阴性管中加入病人全血和同型对照及CD61 PerCP；阳性对照管加入正常人全血和抗体CD42a FITC/CD41 PE；试验管中加入病人全血和抗体CD42a FITC/CD41 PE。

固定后上机分析：
1. FSC、SSC和FL均采用对数方式获取
2. FL2-SSC设门，找到血小板细胞群
3. 分析血小板细胞群的FL1直方图：由阳性对照定界值，报告试验管病人血小板CD42a缺失的百分率 附2：血小板无力症的流式细胞分析 l 分析血小板的IIb/IIIa复合物（CD61或CD41）及其活化结构。

准备阴性对照管、阳性对照管和试验管，进行染色：阴性管中加入病人全血和FITC标记的同型对照；阳性对照管加入正常人全血和抗体CD41 FITC；试验管中加入病人全血和抗体CD41 FITC。

固定后上机：
1. FSC、SSC和FL1均采用对数方式获取
2. FSC-SSC设门，找到血小板细胞群
3. 分析血小板细胞群的FL1直方图：由阳性对照定界值，报告试验管病人血小板CD41缺失的百分率




血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析前言

血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。

使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是：
检测血小板的反应性。
了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。
同时检测多种血小板表面标志。
高度灵敏。
直接检测血小板的多种标志。
使用全血，标本量少。
操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。

BDIS血小板活化试剂组成为：
· PAC-1 FITC：早期血小板活化的标志物，即活化的 gpⅡb/Ⅲa复合物，
抗体与活化后血小板膜表面的gpⅡb/Ⅲa复合物纤维蛋白原结合位点相结合。BDIS抗体为IgM型，建议使用PAC-1结合阻断剂RGDS做阴性对
照。
· CD62P PE：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静
止血小板胞浆内a颗粒含有CD62P，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表达CD62P。
· CD61 PerCP：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与
未活化血小板结合。CD61与CD41联合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物。在本试验中，用FL3设阈值。

试验用品

· 采血管：CTAD真空采血管。（BD公司，CAT.NO.367946）

· 一次性12*75 mm Falcon试管。
· 微量加样器和加样头。
· BD抗体：2-8°C保存。
荧光抗体 FITC PE PerCP
对照管 PAC-1+RGDS IgG1 CD61
试验管 PAC-1 CD62P CD61
· RGDS (PAC-1阻断剂)：用PBS配制，10mg/ml。
· 血小板激活剂：ADP，浓度2