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几十年来，一直认为RNA仅仅从DNA获取遗传信息，并将信息转换成蛋白质。但最近研究发现，小RNA(small RNA)发挥着基因调控的作用。小RNA能关闭基因的表达，或改变基因表达的水平。在发育过程中通过关闭或开放基因的表达，小RNA可能指导着细胞的定向分化并决定细胞的命运[1]。
九十年代初期研究发现21到28个核苷酸的小RNA能抑制植物的基因表达，随后在动物细胞中也发现了这一现象。但直到1998年2月华盛顿卡耐基研究院的Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Mello首次将双链RNA（dsRNA）注入线虫，结果发现诱导了比单独注射正义链或者反义链都要强的基因靶向专一性的基因表达沉默（gene silencing）。他们将这种现象称为RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi）。随后许多研究者先后采用不同长度的dsRNA使线虫、果蝇、植物、动物卵细胞和哺乳类细胞等的靶向基因表达明显降低或沉默，因此人们把这种利用dsRNA使目的基因敲低或使目的基因沉默，从而研究目的基因的功能即为RNA干扰技术（RNAi技术）[2]。RNA干扰技术由于其独特优点在干细胞研究中备受关注和应用。本文主要综述RNA干扰技术在干细胞研究中的应用及其进展。
一、RNAi的机制及其必需基因
1、1 RNAi的机制
实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23nt小片段RNA即siRNA，后者会使目的mRNA被切割为21-23nt的siRNA。Hammond等人部分纯化了一种RNase Ⅲ型酶（如Dicer等），该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的RNase Ⅲ型酶Dicer识别,切割成21-23 nt的siRNA，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA；识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23nt的siRNA,与Dicer形成复合物即RNA诱导基因表达沉默复合物（RISC），继而RISC特异性地对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象[2-4]。就目前的研究知道在各种生物均存在通过不同长度的dsRNA引起基因表达沉默的RNAi现象。如哺乳动物细胞无论RNA干扰活动,它们都有降解长片段dsRNA产生21-22 nt的siRNA的能力。Tuschl研究则进一步说明甚至在几种更长片段dsRNA不能产生RNAi的哺乳动物细胞中，siRNA依然能够引起基因表达沉默[5]。而在哺乳动物细胞长片段dsRNA不能产生RNAi的原因可能是长于30nt的dsRNA掩敝RNAi的IFN反应的非特异性激活。但Billy研究提示在鼠未分化的EC细胞和ES细胞通过长片段dsRNA诱导RNAi引起特异基因表达沉默[6]。同时Yang的研究显示鼠ES细胞通过siRNA诱导RNAi引起相应目的基因沉默。但通过长片段dsRNA和siRNA引起基因沉默的程度目前仍不清楚[7]。
1、2 RNAi的必需基因
通过遗传分析的方法，目前已从线虫中分离到RDE-2，RDE-3和Mut-7等、果蝇中的ago2等、拟南芥中的sgs-2、sgs-3、argonaute1(ago1)、sde1、sde3、caf、ddm-1、met-1等RNAi相关的基因。研究发现这些基因多数属于多基因家族，有很大的保守性。进一步研究发现，许多基因沉默必需蛋白与一些基因表达调控因子结构相似,如拟南芥的DDMI蛋白与染色体再构因子SW12/SNF2相似；拟南芥的MET1是一种维持DNA甲基化转移酶；线虫的RDE-1与翻译因子Eif2C结构相似[3、4]。这可能表明，基因沉默机制在生物的进化中有很大的保守性和多样性。
二、RNAi 在细胞分裂或分化中的作用
通过改变染色体的形状（更紧或更松），能够决定某一个基因表达。近来研究揭示参与RNAi 的siRNA在染色体形状的改变时起着非常重要的作用。这样RNAi 能永久的关闭基因的表达，而不仅仅是短期的抑制它。而我们知道染色体中心粒周围的异染色质控制着细胞的分裂。在比较研究缺乏RNAi 的酵母及正常酵母时，发现当酵母分裂时染色质聚集并移位到细胞的对侧。而在缺乏siRNA 的酵母里，染色体中心粒周围不能正常形成异染色质，细胞分裂也不能正常进行。因此研究者推测siRNA 能促进异染色质聚集到正确的部位并促进细胞分裂的发生。同时在具有将遗传给子代的DNA储存在一个核里，而将表达的DNA 储存在另一个核里特性的四膜虫（Tetrahymena）的研究中发现，当四膜虫分裂时，siRNA 促进一些基因的删除或重组。RNAi 似乎是作用在四膜虫中类似于异染色质的某种结构上，删除或将DNA 移到另一个位置。但机制目前仍不清楚。在酵母和四膜虫中，siRNA的作用集中在基因组的中心粒周围，这个区域包含有转座子造成的基因重复序列。有假说认为siRNA在进化的很早阶段就出现了，以防止转座子造成的基因组不稳定。当然，研究发现RNAi在发育和疾病中也具有作用。研究证实RNAi 能定向诱导植物干细胞（分生组织）的分化，因而研究者认为RNAi 也可能参与人的干细胞的分化。如果在人的细胞分裂中RNAi 的作用也像它在酵母和四膜虫中一样，那么对RNAi 微小的干扰就可能导致细胞命运的转变[1]。
2、1 RNAi 在植物干细胞（分生组织）增殖分化中的作用
在芽尖分生组织发现包含类似动物干细胞一样的干细胞。如果它们处于未分化的状态，将为组织再生提供一干细胞池。研究提示ago1和zwille对于芽生组织中的干细胞具有重要的调控作用[8]。Zwille在芽生组织从胚胎发育到组织形成的过程中，为维持芽生组织中未分化的干细胞起关键作用。在芽尖分化时，Zwille像ago1一样诱导STM(shoot meristemless)基因的表达。而STM基因在整个发育过程中涉及茎端分生组织的结构建成,STM基因是芽生组织功能维持和启动分化所必需的[9]。在Zwille突变的芽尖分生组织，尽管能正确的启动分化，但不能不对称分裂,而牙生组织中心区里的干细胞失去了干细胞的特性，并终末分化[9、10]。
2、2 RNAi在哺乳动物干细胞增殖分化中的作用
线虫sting缺失突变会导致雄性不育。线虫AGO2是基因沉默所必需的，它和Dicer蛋白以及siRNA组成RISC复合体进行特异性降解mRNA,根据最近的研究结果，基因沉默可能通过控制内源基因表达来调控生长发育，而果蝇和线虫利用基因沉默必需元件Dicer加工生成的siRNA来调控发育的时序性[11、12]。而Dicer行使切割功能需要RDE-1或其同源基因ALG1/ALG2的协同[13、14]。
果蝇Agronaute家族成员Piwi是干细胞保持自我更新、不对称分裂等所必需的，piwi过表达影响干细胞的特性，引起干细胞增殖、分裂；而两个与Piwi同源的鼠Agronaute家族成员Miwi和Mili。尽管它们与Piwi有所不同，但它们涉及精子发生和原始生殖细胞的调控，而且目前认为Miwi是精子发生的主要调控开关[15-18]。
在鼠未分化的EC细胞和ES细胞通过长片段dsRNA诱导RNAi引起特异基因沉默的研究中细胞分离和免疫定位发现Dicer位于细胞质。但Dicer在EC细胞的高水平是否与stRNA合成有关，以及是否是胚胎细胞和/或未分化细胞的共同特性，目前仍不很清楚[6]。
同时，在人类干细胞的研究发现人Agronaute家族成员Hiwi在原始造血干细胞（CD34+
骨髓干细胞）表达，而在已分化的血细胞不表达[19]。可能Hiwi表达缺失与干细胞分化有关。
2、3 RNAi 参与调控干细胞增殖分化的机制
在调控各种生物细胞命运以及发育模式的研究中发现参与干细胞功能特性调控的Agronaute家族蛋白也参与了Wingless/Wnt和Hedgehog信号转导途径。譬如：果蝇Agronaute1（dAgo1）是Wingless信号转导途径的调节子。dAgo1过表达挽救了通过细胞质中的转导激活子Armadillo引起Wingless样的表现型。然而，如果Ago1是Wingless信号转导途径的保护成份，那么dAgo1的丢失也就不会产生所期望的表现型[20]。因此，Ago1可能在一并行途径起作用。而类似地，由于在卵巢Hedgehog过表达能弥补Piwi的缺乏，可见Piwi与Hedgehog相并行起作用。这些也就与Hedgehog是干细胞促进因子相一致[21、22]。当然，在人类Wingless信号转导途径与Agronaute家族间也存在联系。如人类Wilm肾肿瘤EIF2C1/hAgo1基因缺失，而这与激活β-磷酸苯丙胺的突变有关[23]。
综上所述：RNAi 可能通过其两个必需基因-Dicer 家族、Agronaute 基因家族参与调控干细胞的增殖分化[2、3]。
三、RNAi技术在干细胞研究中的应用前景
最近通过比较研究胚胎干细胞、造血干细胞和神经干细胞等几类主要的干细胞，结果发现，这些干细胞都含有一组重要的基因，大约283个。同时还对老鼠和人类的造血干细胞进行了比较，也发现这两个不同的物种也都含有这283个基因。这揭示干细胞拥有自己的一套基因组。同期研究揭示至少216个基因是胚胎干细胞、神经干细胞和造血干细胞所独有的。这些基因可能是决定干细胞特性的最关键的实质因素．譬如：不同干细胞具有共同模式的基因（JAK/STAT和TGF-β途径的几个基因）参与干细胞的自我更新等基本功能，Cy28等特征的基因将有利于我们认识干细胞独立的起源位置和发育阶段；Foxd3、Oct4、Fgf4和Sox2基因是干细胞维持多能性所必需的基因.其它一部分分别参与转录调控、细胞周期调控、RNA加工、翻译、蛋白折叠、分子伴侣等过程。而此外大约100多个基因仍然未知。另有研究比较了干细胞周围的干细胞滋养细胞和非滋养细胞的基因活性，发现有4000多个基因在干细胞滋养细胞中表现活跃，而在非滋养性细胞中失去了活性。目前对这些周围细胞仍然缺乏充分认识[24、25]。为此需要弄清上述每个基因的功能及其干细胞固有基因与周围滋养细胞基因之间的网络关系。由于RNAi干扰技术比传统方法（反义核苷酸技术、基因敲除等）更快更方便地使基因表达沉默或基因表达降低，从而为干细胞相关基因功能的研究提供了更有效地工具[1-3]。RNAi干扰技术不仅有利于干细胞基因调控机制的研究，而且有利于研究干细胞的分化及其细胞、基因治疗。例如：通过dsRNA使基因沉默研究干细胞的分化；利用RNAi技术对干细胞的基因做某些修饰如创建\"万能供者细胞\"，即破坏细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免疫排斥效应发生的目的[2、26]。总之，RNAi技术为干细胞生物学研究提供一新的、实用的方法和手段。 |
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发表于 2007-6-13 12:57:44
