沉淀和结晶技术

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沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀技术(即沉淀法、溶解度法)操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
沉淀的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH 值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
结晶是溶液中的过饱和溶质由液相变成晶体析出的过程。

1. 沉淀

中性盐沉淀
中性盐沉淀是在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程，称为”盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA 和rRNA 沉淀，而tRNA 保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。
(1)中性盐沉淀蛋白质的基本原理
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm 颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
(2)中性盐的选择
常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：①溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下(0～4℃)进行。由表2－6可以看到，(NH4)2SO4在0℃时仍有70.6％的溶解度，远远高于其它盐类：
表2－6 几种盐在不同温度下的溶解度(g/100mL 水)

②分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
③不易引起变性：有稳定酶与蛋白质结构的作用，有的酶或蛋白质用2～3mol/L 的(NH4)2SO4保存可达数年之久。
④价格便宜，废液不污染环境。
(3)盐析的操作方法
最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。
各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线性体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，有人经过精心测量，确定出1升纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。
4)盐析曲线的制作
如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：
取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH 值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清液再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH 缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。
(5)盐析的影响因素
①蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。
通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当25mg/mL～30mg/mL。
②pH 值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH 值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH 值常选在该蛋白质的等电点附近。
③温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行，但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。
有机溶剂沉淀
有机溶剂对于许多蛋白质(酶)、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。
(1)有机溶剂沉淀基本原理
主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
有机溶剂沉淀法的优点是：①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其它溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀；②沉淀不用脱盐，过滤比较容易(如有必要，可用透析袋脱有机溶剂)。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
(2)有机溶剂的选择和浓度的计算
用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：

100—指加入的有机溶剂浓度为100％，如所加入的有机溶剂的浓度为95％， 上式的(100－S2)项应改为(95－S2)。
上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
(3)有机溶剂沉淀的影响因素
①温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。
②样品浓度：样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常，使用5mg/mL～20mg/mL 的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。
③pH 值：有机溶剂沉淀适宜的pH 值，要选择在样品稳定的pH 值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH 值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。
④离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。
有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH 值和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。
选择性变性沉淀
这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。
(1)热变性
利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。
(2)表面活性剂和有机溶剂变性
不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，而目的物仍留在溶液中。使用此法时通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活性。
(3)选择性酸碱变性
利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同、pH 值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。
等电点沉淀
等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。
有机聚合物沉淀
有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些近年细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化， 其中应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG)，它的亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。
PEG 的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH 和温度等因素的影响。在一定的pH 值下，盐浓度越高，所需PEG 的浓度越低，溶液的pH 越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG 的浓度越低。在一定范围内，高分子量和高浓度的PEG 沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。
有机聚合物沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性；②沉淀效能高，使用很少量的PEG 即可以沉淀相当多的生物大分子；③沉淀后有机聚合物容易去除。
2.结晶
结晶是溶质以晶态从溶液中析出的过程。由于初析出的结晶多少总会带一些杂质，因此需要反复结晶才能得到较纯的产品。从比较不纯的结晶再通过结晶作用精制得到较纯的结晶．这一过程叫做重结晶(或称再结晶、复结晶)。结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段，变性蛋白质不能结晶，所以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。晶体内部有规律的结构，规定了晶体的形成必须是相同的离子或分子，才可能按一定距离周期性地定向排列而成，所以能形成晶体的物质是比较纯的。在生化制备中，许多小分子物质如各种有机酸、单糖、核苷酸、氨基酸、维生素、辅酶等，由于其结构比较简单，分离至一定纯度后，绝大部分都可以定向聚合形成分子型或离子型的晶体。但有的生化产品，如核酸由于分子高度不对称，呈麻花形螺旋结构，虽已达到很高的纯度，也只能得到絮状或雪花状的固体。
结晶过程的分析
当溶液浓度等于溶质溶解度时，该溶液称为饱和溶液。溶质在饱和溶液中不能析出。溶质浓度超过溶解度时，该溶液称为过饱和溶液。溶质只有在过饱和溶液中才有可能析出。溶解度与温度有关，一般物质的溶解度随温度升高而增加，也有少数例外，温度升高溶解度降低，如红霉素。溶解度还与溶质的分散度有关，即微小晶体的溶解度要比普通晶体的溶解度大。用热力学方法可以推导出溶解度与温度、分散度之间的定量关系式，即凯尔文(Kelvin)公式：

结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这些分子有规律地排列在一定晶格中。这种有规律的排列与表面分子化学键力变化有关，因此结晶过程又是一个表面化学反应过程。
形成新相(固相)需要一定的表面自由能，因为要形成新的表面就需对表面张力做功。因此溶液浓度达到饱和浓度时，尚不能析出晶体，当浓度超过饱和浓度，达到一定的过饱和浓度时，才可能有晶体析出。最先析出的微小颗粒是以后结晶的中心，称为晶核。如上所述，微小的晶核具有较大的溶解度，因此，在饱和溶液中，晶核是要溶解的，只有达到一定过饱和度时，晶核才能存在。晶核形成后，靠扩散而继续成长为晶体。因此，结晶包括三个过程即：过饱和溶液的形成；晶核的形成及晶体的生长。溶液达到过饱和状态是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。
物质在一般溶解时吸收热量，在结晶时放出热量，称为结晶热，因此结晶又是一个同时有质量和热量传递的过程。
溶解度与温度的关系还可以用饱和曲线和过饱和曲线表示，如图2－9。
曲线SS 为饱和溶解度曲线，在此线以下的区域为不饱和区，称为稳定区。曲线TT 为过饱和溶解度曲线，在此曲线以上的区域称为不稳区。而介于曲线SS 和TT 之间的区域称为亚稳区。在稳定区的任一点溶液都是稳定的，不管采用什么措施都不会有结晶析出。在亚稳区的任一点，如不采取措施，溶液也可以长时间保持稳定，如加入晶种，溶质会在晶种上长大，溶液的浓度随之下降到SS 线。
亚稳区中各部分的稳定性并不一样，接近SS 线的区域较稳定。而接近TT 线的区域极易受刺激而结晶。因此有人提出把亚稳区再一分为二，上半部为刺激结晶区．下半部为养晶区。
在不稳区的任一点溶液能立即自发结晶，在温度不变时，溶液浓度自动降至SS线。因此，溶液需要在亚稳区或不稳区才能结晶，在不稳区，结晶生成很快，来不及长大，浓度即降至溶解度，所以形成大量细小晶体，这在工业结晶中是不利的。为得到颗粒较大而又整齐的晶体，通常需加入晶种并把溶液浓度控制在亚稳区的养晶区，让晶体缓慢长大，因为养晶区自发产生晶核的可能性很小。晶体产量取决于固体与溶液之间的平衡关系。固体物质与其溶液相接触时，如果溶液未达到饱和，则固体溶解；如果溶液饱和，则固体与饱和溶液处于平衡状态，溶解速度等于沉淀速度。只有当溶液浓度超过饱和浓度达到一定的过饱和程度时，才有可能析出晶体。由此可见，过饱和度是结晶的推动力，是结晶的关键。
(1)饱和溶液的形成要获得理想的晶体，就必须研究过饱和溶液形成的方法。通常工业生产上制备过饱和溶液的方法有五种，下面分别加以介绍①热饱和溶液冷却该法适用于溶解度随温度降低而显著减小的场合，即溶解度随温度升高而显著减小的场合宜应采用加温结晶。由于该法基本不除去溶剂，而是使溶液冷却降温，也称之为等溶剂结晶。
②部分溶剂蒸发
蒸发法是借蒸发除去部分溶解剂的结晶方法，也称等温结晶法，它使溶液在加压，常压或减压下加热蒸发达到过饱和。此法主要适用于溶解度随温度的降低而变化不大的物系或随温度升高溶解度降低的物系。蒸发法结晶消耗热能最多，加热面结垢问题使操作遇到困难，一般不常采用。
③真空蒸发冷却法
真空蒸发冷却法是使溶剂在真空下迅速蒸发而绝热冷却，实质上是以冷却及除去部分溶剂的两种效应达到过饱和度。此法为自50年代以来一直应用较多的结晶方法。这种方法设备简单，操作稳定。
最突出的特点是容器内无换热面，所以不存在晶垢的问题。
④化学反应结晶法
化学反应结晶法是加入反应剂或调节pH 值使新物质产生的方法，当其浓度超过溶解度时，就有结晶析出。
⑤盐析法
盐析法是向物系中加入某些物质，从而使溶质在溶剂中的溶解度降低而析出。这些物质被称为沉淀剂，它们既可以是固体，也可以是液体或气体。沉淀剂最大的特点是极易溶解于原溶液的溶剂中。
这种结晶的方法叫做盐折法，常用沉淀剂有中性盐、甲醇、乙醇和丙酮等。
(2)晶核形成
晶核形成是一个新相产生的过程，由于要形成新的表面，就需要对表面做功。所以晶核形成时需要消耗一定的能量才能形成固液界面。自动成核时，体系总的吉布斯自由能的改变为ΔG，它由两项组成：一项为表面过剩吉布斯自由能ΔGs(固体表面和主体吉布斯自由能的差)；另一项为体积过剩吉布斯自由能ΔGv(晶体中分子与溶液中溶质吉布斯自由能的差)。显然，ΔGs 为正值，其值为界面张力与表面积的乘积，而在过饱和溶液中，ΔGv 为负值。若完整考虑，必须满足ΔG＝ΔGs 十ΔGv＜0的条件，才能形成新相核心—晶核。ΔGv 是负值，推动晶核产生，一旦产生晶核，必须形成新的界面；
ΔGs 是正值，阻碍晶核形成。能否产生晶核，取决于两者的相对大小。
晶核形成过程中应注意成核速度，即单位时间内在单位体积溶液中生成新晶核的数目。成核速度是决定晶体产品粒度分布的首要动力学因素。工业结晶过程要求有一定的成核速度，如果成核速度超过要求，必将导致细小晶体生成，影响产品质量，因此应避免过量晶核的形成。
晶体过程考虑因素
(1)纯度
纯度是指所需要的组分在样品总量中所占的比例(一船为质量分数)。杂质占比例越低，则所制备物质的纯度越高。各种物质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出结晶，这样就可使结晶和母液分开，以达到进一步分离纯化的目的。生化产品也不例外，一般说来纯度愈高愈易结晶。就蛋白质和酶而言，结晶所需纯度不低于50％，总的趋势是越纯越易结晶。结晶的制品并不表示达到了绝对的纯化，只能说达到了相当纯的程度。但有时纯度虽不高，若加入有机溶剂和制成盐时，也能得到结晶。
(2)浓度
结晶液一定要有合适的浓度，溶液中的溶质分子或离子间便有足够的相碰机会，并按一定速率作定向排列聚合才能形成晶体。但浓度太高达到饱和状态时，溶质分子在溶液中聚集析出的速度太快，超过这些分子形成晶体的速率，相应溶液粘度增大，共沉物增加，反而不利于结晶析出，只获得一些无定形固体微粒，或生成纯度较差的粉末状结晶。结晶液浓度太低，样品溶液处于不饱和状态，结晶形成的速率远低于晶体溶解的速率，也得不到结晶。因此只有在稍过饱和状态下，即形成结晶速率稍大于结晶溶解速率的情况下才能获得晶体。结晶的大小、均匀度和结晶的饱和度有很大关系。如在味精(谷氯酸钠)的结晶过程中，只有在溶液保持适当的浓度，形成的结晶才最佳，浓度过高时，结晶液发生混浊现象，表明新的晶核大量形成，此时须用热的蒸馏水调节到合适浓度才能消除混浊现象，获得整齐的较大结晶。
(3)pH 值
pH 值的变化可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质分子溶解度的一个重要因素。在一般情况下，结晶液所选用的pH 值与沉淀大致相同。蛋白质、酶等生物大分子结晶的pH 值多选在该分子的等电点附近。如溶菌酶的等电点为11.0~11.2，5％溶菌酶溶液，pH 值9.5~10，在4℃放置过夜便析出结晶。如果结晶时间较长并希望得到较大的结晶时，pH 值可选择离等电点远一些，但必须保证这些分子的生物活性不受损害。细胞色素c 的等电点为9.8~10.1，其质量分数为1％，pH 6.0左右生成的结晶最佳。当然对不同蛋白质及生化产品所要求的pH 值范围宽窄不一，要视具体情况来定。
(4)温度
冷却的速度及冷却的温度直接影响结晶效果．冷却太快引起溶液突然过饱和，易形成大量结晶微粒，甚至形成无定形沉淀。冷却的温度太低，溶液浓度增加，也会干扰分子定向排列，不利于结晶的形成。生物大分子整个分离纯化过程，包括结晶在内，通常要求在低温或不太高的温度下进行。低温不仅溶解度低，而且不易变性，并可避免细菌繁殖。在中性盐溶液中结晶时，温度可在0℃至室温的范围内选择。
(5)时间
结晶的形成和生长需要一定时问，不同的化合物，结晶时间长短不同。蛋白质、酶等生物大分子结晶时，由于分子内有许多功能基团和活性部位，其结晶的形成过程也复杂得多。简单的无机或有机分子形成晶核时需要几十甚至几百个离子或分子组成。但蛋白质分子形成晶核时，只需很少几个分子即可，不过这几个分子整齐排列成晶核时比几十个、几百个分子、离子所费时间多得多，所以蛋白质、核酸等生物大分子形成结晶常需要较长时间，因此经常需要放置。在生化产品制备中，时间不宜太长，通常要求在几小时之内完成，以缩短生产周期，提高生产效率。
(6)晶种
不易结晶的生化产品常需加晶种。有时用玻璃棒摩擦容器壁也能促进晶体折出。需要晶种形成结晶的产品，大多数收率不高。