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一、免疫荧光法
１．直接法
（1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。
（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃ 过夜
（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次
（4）50%甘油缓冲液封片
（5）荧光显微镜下检查
（6）对照染色
①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。
对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。
2．间接法
（1）标本处理同直接法。
（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃ ３０～６０分钟或４℃过夜。
（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃ ３０～６０分钟。
（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。
（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。
（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。
３．补体法
（１）标本处理同直接法。
（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。
（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃ ３０分钟。ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。
（４）甘油缓冲液封片。
（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃ ３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。
４．双重色疫荧光法
在同一标本上有两种抗原需要直接显示时，可用不同的荧光素分别标记抗体进 行染色。
一步法双染色：先将两种标记抗体按适当比例混合，按直接法步骤进行。
二步法双染色：先用一个标记抗体孵育，不必洗，再用另一个标记抗体孵育，按间接法步骤进行。
５．注意事项
（１）免疫荧光法最适宜进行冰冻切片的染色，因为此种切片一般抗原保存得较好。若是石蜡切片则应首先选用免疫酶法等染色技术。
（2）使用商品的荧光标记抗体，在进行染色前应作抗体效价的测定，找出合适的稀释度后再进行成批染色。一般而言，在阳性物质发出明亮荧光而背景又较暗时的稀释度是较为合适的。高稀释度的荧光抗体可以减少非特异性着色使染色结果更具特异性，但稀释度过高会导致假阴性的出现。低稀释度的荧光抗体使结果较易观察，但会带来非特异性的着色，甚至出现假阳性的结果。
（3）非特异荧光的消除。非特异性荧光的消除方法较多。一般而言，冰冻切片的非特异性荧光较强，石蜡切片的非特异性荧光较弱。常用的方法有①先用非免疫血清如10％牛血清等处理切片，然后再行荧光染色。②用小鼠相应组织的干粉吸收荧光抗体中的非特异性成分。③选择合适的稀释度和切片。④选用高特异性和高效价的荧光抗体。
（4）洗涤要彻底。每道程序都有用蒸馏水或缓冲液洗涤以清除残留在切片中的试剂，以达到特异着色的目的。洗涤时不论是冲洗还是振荡洗涤，其基本原则是要达到洗涤干净的目的，或者说充分稀释上一道程序中的试剂，使其含量降至最低。一般只要有足够的时间，以静置廷长每次洗涤时间为宜，这是防止脱片的较好办法。洗涤液的PH值应为7.2~7.4之间，过高过低的不利于染色过程，尤其是在偏碱的PH值条件下。
（5）孵育时间与温度。免疫荧光法一般孵育温度在37℃，时间为20——30分钟时是最佳时间与温度。当然，也与抗体的效价，组织抗原的含量与部位，切片的厚度等有关。
二、免疫酶法
免疫酶法的最大优势是特别适用于石蜡切片的染色，并且用一般光学显微镜就能观察，定位也较荧光显微镜下精确。
1.直接法
（1）组织切片常规脱蜡入水。
（2）胰酶或胃蛋白酶消化，37℃0.5—2小时。水洗。
（3）0.3％H2O2甲醇液（封闭内源性酶）10—15分钟。冰冻切片、细胞涂片从此步骤开始。
（4）水洗后经PBS洗1—2次。
（5）正常血清或牛血清白蛋白孵育15分钟。室温。
（6）甩掉覆盖在切片上的上述（5）血清，加酶标记抗体，37℃ 30分钟。置温盒内。
（7）PBS洗3次。
（8）显色。在酶的底物溶液中於显微镜下观察控制呈色反应，以结果清晰，背景无非特异性染色为度。
（9）自来水充分冲洗。
（10）需要时用Mayer’s苏木素复染胞核。
（11）封片。若用DAB等呈色，可经酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。若用AEC等则不能用酒精脱水，用吸水纸去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（例如明胶甘油）封片。
（12）对照染色。直接法应有严格的对照染色。可设空白对照、阳性对照及抑制试验。（方法见前）。
2．间接法
（1）~（5）同直接法。
（6）甩掉正常血清滴加适当稀释度的特异性抗体，37℃，30—60分钟4℃过夜，置湿盒中。
（7）PBS洗3次。
（8）滴加适当稀释的酶标抗体（例如羊抗兔GHRP标记抗体，此时特异性抗体应为兔源性的抗体）于标本上，室温或37℃30分钟。
（9）PBS洗3次。
（10）以后步骤同直接法。
3.酶桥法
（1）~（5）同直接法。
（6）滴加适当稀释的特异性抗体（如兔抗人IgG）4℃16—24小时。置湿盒中。
（7）PBS洗3次。
（8）加桥抗体（如羊抗兔IgG），用5％正常人血清稀释可消除交叉染色，室温或37℃30分钟。
（9）PBS洗3次。
（10）加兔抗酶抗体（如兔抗HRP抗体）37℃30分钟置湿盒中。
（11）PBS洗3次。
（12）加酶溶液（如HRP50—100ug/ml），室温30分钟置湿盒中。
（13）PBS洗3次，双蒸水洗1次。
（14）用酶底物显色（如DAB+过氧化氢），在显微镜下控制显色过程。余同直接法。
4.PAP法
（1）——（5）同直接法
（6）滴加适当稀释的特异性抗体（小鼠抗人IgG，即鼠单抗）37℃30——60分钟或4℃过夜，置湿盒中。
（7）PBS洗。
（8）加兔抗小鼠IgG抗体，37℃30分钟。
（9）PBS洗3次。
（10）加PAP抗体（鼠PAP抗体）37℃30——40分钟。
（11）PBS洗3次。
（12）同直接法。
5.双PAP法
（1）同PAP法（1）—（11）。
（2）重复第二抗体即兔抗小鼠IgG抗体，但稀释度是前次的一倍，37℃ 30分钟置湿盒中。
（3）PBS洗3次。
（4）重复PAP抗体即鼠PAP抗体，同样，稀释度也应比前次大一倍，37℃ 30分钟置湿盒中。
（5）PBS充分洗3次。
（6）同直接法。
6. APAAP法
（1）冰冻切片或细胞涂片用PBS浸泡3分钟，石蜡切片常规脱蜡后胰酶消化，PBS洗3次。
（2）正常羊血清（1：10——50）室温20分钟。
（3）适当稀释的特异性抗体，37℃60分钟，或4℃过夜。
（4）PBS洗3次。
（5）桥抗体（如羊抗鼠或羊抗兔IgG1：100——200），37℃40分钟或室温1小时。
（6）PBS洗3次。
（7）滴加适当稀释的APAAP复合物，37℃30分钟。
（8）PBS洗3次。
（9）滴加（或浸入）AKP底物溶液，37℃15——30分钟，阳性结果显现清晰后流水冲洗。
（10）复染（核固红或苏木素或甲基绿）1——2分钟，常规冲洗后，甘油明胶封片。
7.注意事项
（1）免疫酶最适宜进行石蜡切片的染色，为回顾性研究创造了条件。对保存时间较久的石蜡标本或在制作石蜡块的过程中抗原成分丢失或被封闭的组织，酶的消化是非常重要的。应根据组织及抗原的情况选择适当的胰酶浓度进行消化。最常用的为0.1~0.5％胰蛋白酶和0.4％的胃蛋白酶.
（2）除直接法，特别是酶桥法和双PAP法，由于步骤较多，每步骤间的冲洗就显得非常重要，常常是导致染色失败或结果不理想的主要原因。
（3）各级抗体的稀释度是染色成败的关键。一般而言，特异性一抗的稀释度应尽可能高，桥抗体的浓度要足够，酶标抗体或抗酶抗体的稀释度要适中。
（4）用HRP作为标记酶，要注意封闭内源性的HRP的干扰，若封闭效果不理想，也可以将H2O2甲醇作用于切片的步骤移至特异性的抗体孵育之后进行，或两次封闭，即切片消化之后和加桥抗体之前。
三、免疫金银法
1. 免疫金法（IGS）
（1）切片常规脱蜡入水。
（2）0.05M TBS PH7.4 洗10分钟。
（3）1％卵蛋白作用切片15分钟。
（4）滴加特异性一抗，室温2小时后4℃过夜。
（5）0.5M TBS PH7.4洗3次。
（6）0.02M TBS PH7.4(内含0.1％牛血清白蛋白)5分钟.
（7）1％ 孵蛋白作用切片15分钟。
（8）胶体金标记SPA（萄萄球菌A蛋白，详见亲和免疫细胞化学技术一章）室温孵育1~2小时。
（9）0.02M TBS PH7.4洗3次。
（10）双蒸水洗2次。
（11）1％戌二醛10分钟。
（12）双蒸水洗3次。
（13）复染、封片、观察。
结果：胶体金结合部位呈鲜樱红色。
2．免疫金银法
（1）切片常规脱蜡入水。
（2）经含汞固定液固定的组织切片需经0.5％碘酒精脱汞,然后入0.5％硫代硫酸纳水溶液脱碘,再用流水冲洗10分钟,蒸馏水洗后入0.05M TBS PH7.4液冲洗.
（3）抗原性较弱的组织切片，需经0.1％胰蛋白酶液消化，37℃ 30分钟，抗原性较强的组织可免去此步骤。
（4）正常羊血清（1：5或1：10）作用10分钟，吸去，不洗涤。
（5）滴加适当稀释的特异性抗体37℃ 30—60分钟或4℃过夜，室温复温2小时。
（6）0.05M TBS PH7.4 液洗3次。
（7）0.02M TBS PH7.2 液洗3次。
（8）正常羊血清（1：5）10分钟，吸去，不洗涤。
（9）滴加适当稀释的金标记抗体（如金标记羊抗兔IgG抗体，此时特异性抗体为兔源性）室温下1小时后4℃过夜。
（10）0.02M TBS PH8.2液洗3次。
（11）0.05M TBS PH7.2 液洗3次。
（12）蒸馏水洗2次，双蒸水洗2次。
（13）入银显影液中3—5分钟或阿拉伯胶银液中20—40分钟，反应过程需避光。
（14）蒸馏水洗。
（15）自来水冲洗，苏木素淡复染。
（16）脱水、透明、封片、观察。
结果：特异性抗体结合部位呈灰黑色颗粒，背景呈清灰色，核呈淡蓝色。
3．注意事项
（1）染色过程中若用标记葡萄球A蛋白代替金标记间接抗体，需用1%卵蛋白处理切片。0.02M TBS均为 PH7.4。若用金标记间接抗体，则用正常羊血清处理切片，0.02MTBS应为PH8.2，要注意PH值变化时的良好过渡，不可直接由蒸馏水入PH8.2的TBS，应经PH7.4过渡。
（2）对不经含汞液固定的组织，若也经碘液的处理，有作者认为染色结果更为满意。
（3）切片入银显影液应避光，最好是在暗室内用红色安全灯监测染色反应强度。显影液用重蒸水配制反应速度很快，用阿拉伯胶配制则反应速度较慢，容易掌握。 |
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发表于 2007-6-8 09:00:30