酵母菌单倍体原生质体融合

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基本原理
进行微生物原生质体融合时，首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍。在酵母属进行细胞融合时，通常采用蜗牛酶除去细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞膜融合之后还必须经过细胞质融合、细胞核重组、细胞壁再生等一系列过程，才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是形成异核体，即染色体DNA 不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一是形成重组融合子，通过连续传代、分离、纯化，可以区别这两类融合。应该指出，即使真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离，纯化才能获得稳定的融合子。
三、实验材料
(一) 菌种

(三) 缓冲液
(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融剂
40％聚乙二醇 (PEG)的SMM 溶液。
(六) 器皿
培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、离心管、玻璃棒、显微镜、离心机等。
四、试验内容
(一) 原生质体的制备
1．活化菌体
将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接新鲜斜面。自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30℃培养16 h 至对数期。
2．离心洗涤、收集细胞
分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。将二株菌体分别悬浮于5 mL 高渗缓冲液中，振荡均匀，分别取样0.5 mL，用生理盐水稀释至10-6，分别各取0.1 mL 10-4、10-5、10-6 稀释液。于相应编号的完全培养基平板上(每个稀释度做两个平板)，用刮棒涂布，30℃培养48 h 后进行二亲株的总菌数测定。
3. 酶解脱壁
各取3 mL 菌液于无菌小试管中，3000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入3 mL 含2.0 mg 蜗牛酶的高渗缓冲液(此高渗缓冲液含有0.1％EDTA 和0.3％SH-OH）于30℃振荡保温，定时取样镜检观察至细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成。
(二) 原生质体再生及剩余菌数的测定
1．再生
分别吸取0.5 mL 原生质体(经酶处理)加入装有4.5 mL 高渗缓冲液及4.5 mL 无菌水试管中。经高渗缓冲液稀释至10-5；分别吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5。稀释液于相应编号的再生培养基平板上，30℃培养48 h 后，进行再生菌数测定(用双层再生培养基)。
2. 未脱壁菌数测定
分别取0.5 mL 原生质体至装有无菌水试管中，稀释到10-4；各取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 的稀释液于相应编号的完全培养基平板上，30℃培养48 h 后，进行未脱壁菌数测定。
原生质体融合
1. 除酶
取两亲本原生质体各1 mL，混合于灭菌小试管中，2500 r/min 离心 10min，弃上清液，用高渗缓冲液离心洗涤二次，除酶。
2. 促融
向上述沉淀菌体中加入0.2 mL SMM 溶液，混合后再加入1.8 mL 40％PEG，轻轻摇匀，32℃水浴保温2 min 立即用SMM 溶液适当稀释(一般为100、10-1、10-2)。
3．再生
取融合后的稀释液各0.1 mL，放于冷却至45℃左右的6 mL 固体再生基本培养基试管中，迅速混匀，倒入带有底层再生培养基的平板上，每个稀释度做两次重复，30℃培养96 h，检出融合子。
4．融合子的检验
用牙签桃取原生质体融合后长出的大菌落点种在基本培养基平板上，生长者为原养型即重组子。传代稳定后转接于固体完全培养基斜面上，而亲本类型在基本培养基上是不生长的。

附录 酵母原生质体融合试验用培养基
(包括酵母单倍体原生质体融合及电场诱导酵母原生质体融合）
1. 完全培养基
葡萄糖 2 g
蛋白胨 2 g
酵母膏 1 g
蒸馏水 100 mL
pH 7.2
100 Pa 灭菌20 min。
如需配成固体完全培养基时，则需在上述液体培养基中加入2％琼脂。
2. 基本培养基(用于单倍体酵母原生质体融合试验)
(1) 葡萄糖柠檬酸钠培养基
葡萄糖 0.5 g
(NH4)2SO4 0.2 g
柠檬酸钠 0.1 g
MgSO4·7H2O 0.02 g
K2HPO4 0.4 g
KH2PO4 0.6 g
纯化琼脂 2 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100Pa 灭菌20 min。
(2) YNB 培养基
葡萄糖 2 g
酵母氨基(YNB)* 0.67 mL
琼脂(经纯化处理) 2.0 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100 Pa 灭菌20 min。
3. 再生完全培养基
在固体完全培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖(或0.8 mol/L 甘露醇或1 mol/L 山梨醇）。
4. 基本培养基(用于电场诱导酵母原生质体融合试验)
葡萄糖 2 g
酵母氨基(YNB)* 0.67 mL
琼脂(经纯化处理) 2.0 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100 Pa 灭菌20 min。
*YNB 培养基由以下A、B、C 三种溶液混合而成，取A 1 mL，B 1 mL，C 10 mL，无离子水 1000mL， pH6.5。
A 液 维生素混合液VB1 1000 mg，箊酸400 mg，吡哆醇 400 mg，生物素 20 mg，泛酸钙2 000 mg，VB2 200 mg，肌醇10 000 mg，对氨基苯甲酸 200 mg，无离子水l 000 mL，
B 液 微量元素混合液 H3BO4 500 mg，MnSO4·7H2O 200 mg，ZnSO4·7H2O 400 mg，CuSO4·5H2O 40
mg，FeCl3·6H20 100 mg，Na2MnO4 200 mg，无离子水1000 mL，
C 液 其他无机盐KI 0.1 mg，CaCl2·2H2O 0.1 g，K2HPO4 0.15 g，KH2PO4 0.85 g，MgSO4·7H2O 0.5
g，NaCl 0.1 g，无离子水1000 mL。
5．再生基本培养基
在基本培养基中加入1 mol/L 山梨醇。