间接凝集反应技术

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一、概述

（一）原理
可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒（称为载体）表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。
载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。间接凝集反应的优点为：①敏感性强：间接凝集反应是最敏感性的血清学反应方法之一，可以检测到微量的抗体和抗原；②快速： 一般1h～2h即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟；③特异性强；④使用方便、简单。
（二）载体
具有吸附抗原（或抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。
良好载体有如下几点基本要求：①在生理盐水或缓冲液无自凝倾向；②大小均匀；③比重与介质相似，短时间内不能沉淀；④无化学或血清学活性；⑤吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。
目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。而后者应用更广，因为其来源方便。另外绵羊红血球的表面有大量的（约1 000个以上）糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。
（三）间接凝集的分类
1．根据载体的不同，可分为间接炭凝、间接乳胶凝集和间接血凝等。
  2．根据吸附物不同可分为间接凝集反应（吸附抗原）和反向间接凝集反应（吸附抗体）。
  3．根据反应目的不同，又可分为间接凝集抑制反应和反向间接凝集抑制反应。

4．根据用量和器材的不同又可分为试管法（全量法）、凹窝板法（半微量法）和反应板法（微量法）。

二、间接炭凝反应

（一）原理
  间接炭凝集反应简称炭凝。它是以炭粉微粒作为载体，将已知的抗体球蛋白吸附于这种载体上，形成炭粉抗体复合物，当炭血清与相应的抗原相遇时，二者发生特异性结合，形成肉眼可见的炭微粒凝集块。
目前炭凝反应已用于炭疽、鼠疫和马副伤寒性流产等病的诊断。
（二）材料与试剂
  1．炭粉 炭粉粒子最好大小在0.12mm～0.15mm，目前市场上出售的炭粉均不合要求，必须过300目/寸的标准筛以300r/min离心去沉淀，再以3 000r/min离心去上清，收集沉淀物。
  2．高免血清
  3．待测标本
  4．灭活兔血清
  5．正常血清
  6．标准抗原
  7．0.05mol/L pH7.2PBS液
  8．1％硼酸的PBS液
（三）操作方法
  1．炭致敏 取湿炭粉0.25g（干粉0.10g），加入经56℃～60℃灭活30min的稀释高免血清3ml，充分摇匀，置37℃致敏30min，不时摇动，取出后用pH 7.2 PBS液洗涤3次。最后一次用含1％硼酸和1％兔血清的PBS液洗涤一次，离心去上清，再取此液3ml，混匀即可。同时以正常血清致敏的炭粒处理，以作对照。
致敏血清（加1/万硫柳汞防腐）于室温或4℃冰箱中保存，一年内有效。
  2．取洁净玻璃板一块，以玻璃铅笔划成小格，加被检标本0.10ml，再加免疫炭血清0.05ml，充分混匀，静止1min~5min，判定结果。同时设三个对照：
⑴免疫炭血清+标准抗原。
⑵正常炭血清+标准抗原。
⑶正常炭血清加待检抗原。

（四）结果判定
在对照完全成立的情况下，判定本试验结果：
“＋＋＋＋”：炭粉全部凝集，液体完全清亮透明。
“＋＋＋” ：炭粉大部分凝集，液体透明。
“＋＋”  ：炭粉一半凝集，液体较透明。
“＋”   ：炭粉微凝集，但与对照有差别，液体混浊。
“—”   ：炭粉不凝集，液体不透明。
炭凝以“＋＋”做为反应滴度的终点。

三、反向间接乳胶凝集反应

（一）原理
同炭凝，只是载体换为聚苯乙烯乳胶，它是一种由0.6μm～0.7μm的颗粒所组成的胶体溶液，具有良好的吸附蛋白质的性能。
间接乳胶凝集目前已用于鼠疫菌、沙门氏菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌、葡萄球菌肠毒素等的诊断。
（二）材料与试剂
1．聚苯乙烯乳胶
2．免疫血清
3．正常血清
4．标准抗原
5．待检抗原
6．0.02Mol/L pH8.2硼酸缓冲液
硼砂         6.67g
硼酸         8.04g
H2O     加至 1 000ml
  7．生理盐水
（三）操作方法
1．乳胶液制备 取聚苯乙烯乳胶0.10ml，加灭菌蒸馏水0.40ml，再加pH8.2硼酸缓冲液2ml，混合后即为25倍稀释的乳胶液。
2．乳胶致敏 在上述乳胶液中滴加稀释的免疫血清0.20ml～0.70ml，边加边摇，当出现肉眼可见的颗粒后，仍继续加血清，直至颗粒消失，成为均匀的乳胶悬液为止。镜下检查应无自凝。使用时，应与一定稀释度的相应抗原出现阳性反应，与生理盐水出现阴性反应为合格。加防腐剂后，于冰箱内保存。注意防止冰冻。
同时以正常血清代替免疫血清进行乳胶致敏，以作对照。
3．取洁净玻板一块，用玻璃铅笔划成小格，滴加待检样品0.10ml，再滴加高免血清致敏乳胶0.01ml，以牙签或火柴杆混匀，在3min内判定结果。
（四）结果判定
  “＋＋＋＋”：全部乳胶凝集，成絮状团块，液体清亮。
  “＋＋＋” ： 大部分乳胶凝集成较小的颗粒，液体清亮。
  “＋＋”  ：  半量乳胶凝集成细小颗粒，液体混浊。
  “＋”   ：   较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒，液体混浊。
  “－”   ：   全部乳胶仍为均匀液体，无颗粒。
  以“＋＋”作为该反应滴度的终点。

四、 间接红血球凝集反应

间接红血球凝集反应（简称间接血凝）是间接凝集反应中应用最广的一种方法。
（一）原理
以红血球为载体的间接凝集反应叫做间接血凝。将抗原吸附在红血球上用以检测微量抗体称为正向间接血凝，以抗体吸附于红血球上，检测相应的抗原，称为反向间接血凝。
用抗原吸附红血球，一般比较容易，但用免疫血清吸附红血球，则困难得多，而且往往不易获得良好的结果，因为免疫血清中的成分非常复杂。许多其他蛋白质和非抗体活性的免疫球蛋白占据红血球的表面，而影响血球的特异性凝集。
（二）材料与试剂
1．红血球
2．反应板 分聚苯乙烯塑料板和有机玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔两种规格。按孔型又可分为V和U型两种，V型具有更典型的凝集模型，U型有时比V型的血清效价高1～2孔。反应板不能煮沸消毒和浸泡于来苏儿水中。消毒可用0.5％甲醛溶液，1％新洁尔灭及紫外线照射等。
  3．稀释棒 由合金制成。棒头有8条沟，吸液量为0.025ml，通过火焰，使表面氧化变粗易于吸取液体。它的作用是蘸取、转移、混合液体。为了长期保持棒头的氧化层，每使用20次左右，应过火焰一次。
  4．标准滴管 每滴0.025ml。
  5．微型振荡器
  6．兔血清盐水 作为稳定剂，用于悬浮致敏红血球以及稀释供试血清。制法为：无菌采取兔血，收集血清，灭活后4℃保存。同时，取所需量加4倍量的2.5％血球悬液，混匀，37℃水浴10min，以吸附异嗜性凝集素，离心后取上清；再以pH7.2PBS稀释成1％兔血清盐水，冰箱保存可供数日内之用。
7．抗原 尽可能使用高纯度的抗原。
8．供试血清或其它含抗体材料 供试血清必须灭活，加9倍2.5％的红血球悬液，37℃水浴10min～20min，进行吸收，然后离心，取上清，即为1:10的血清稀释液。
9．醛化剂 甲醛、戊二醛、丙酮醛等。
10．优质鞣酸
11．0.15Mol/L pH6.4PBS液，用于红血球致敏。
12．0.15Mol/L pH7.2PBS液，用于一般稀释液。
13．0.02％牛血清白蛋白PBS液
14．生理盐水
（三）红血球的处理
  1．新鲜红血球 新鲜红血球用阿氏液保存于4℃，可供3周内使用。采用新鲜红血球做凝集反应，模型新鲜，典型，而且敏感性也比醛化红血球高出1～2个滴度。但用新鲜红血球致敏后，保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红血球均有差异，影响试验结果和分析。为了克服这一缺点，目前多采用醛化红血球或鞣化红血球。
2．红血球醛化极其优点
（1）醛化方法：常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。
甲醛醛化过程：①将红血球用pH7.2PBS反复洗涤4次，以除去血清蛋白以及红血球表面的胶体物质；②按1︰8的比例取红血球（压积）和3％甲醛液（用pH7.2PBS稀释，预先冷却至4℃），缓慢混合，加胶塞4℃作用24h，不时摇动；③倾去上清液，再以1︰2（V／V）加入36％～38％冷的（10℃）甲醛溶液，混匀，再放入4℃24h；④⑷离心去上清，以生理盐水反复洗涤4次。彻底清除甲醛液，最后以生理盐水配成10％悬液甲醛化红血球，加1／万硫柳汞防腐，4℃保存。
戊二醛醛化过程：①取新鲜红血球，以生理盐水洗涤4次；②以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1％戊二醛溶液，4℃保存备用；③将100ml 1％冰冷的戊二醛液加入到10ml～15ml红血球中，边加边搅拌（也可置电磁搅拌器上）30min；④离心去上清，以生理盐水洗涤4次，最后以PBS液（或生理盐水）配成10％悬液，加1／万硫柳汞，4℃保存。
丙酮醛—甲醛双醛化过程：①取新鲜红血球，洗涤4次，配成8％的悬液；②于红血球悬液中加等量的3％丙酮醛室温电磁搅拌16h～18h；③洗涤5次，再配成8％的悬液；④于红血球悬液中加等量的3％甲醛，电磁搅拌16h～18h；⑤洗涤5次，最后以pH 7.2 PBS配成10％的悬液，加1／万硫柳汞防腐，4℃保存。
（3）醛化红血球的优点：①性质稳定，不影响红血球表面的吸附能力；②重复性好，易标准化。③可较长期保存，醛化后4℃保存，有效期可至1年，如冻干保存，有效期则更长。
（4）影响醛化的因素：①红血球的洁净程度：由于红血球表面残留血浆蛋白和其它胶质，易引起自家凝集，所以一定要充分洗净；②红血球的浓度：醛化时应尽量使红血球稀释度低一些，以减少红血球的凝集和变形；③醛化时的温度与醛化红血球的质量有很大关系，一般认为最好是37℃。但有人认为应于4℃进行醛化；④醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大，易引起红血球皱褶，浓度过低，又会增加溶血机会，所以一般以3％醛化浓度为宜。家禽红血球一般醛化1～2次即可，而哺乳动物红血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存时间也长。不同的双醛化，其抗原致敏作用有所不同，表5－1是各种双醛化法的结果比较。
表5－1 各种双醛化红细胞的结果比较
脉冲／min是131I标记的特异性抗体结合到细胞上的指标，脉冲数越大，结合抗体量也越多。但是从表5－1中可以看出结合量同可测出的抗原滴度是不平行的。
适当的振荡可使醛化剂与红血球充分接触，并可排除凝块形成。但过分地振荡，则易产生气泡，引起红血球变形。
  3．红血球鞣化 多糖、脂多糖、类脂等一些半抗原易于吸附红血球表面，所以一般醛化处理即可。但对于许多蛋白质抗原，由于不易吸附于红血球表面，所以在醛化的基础上，必须再以一定浓度的鞣酸进行处理，强化它对蛋白质的吸附能力。
有人认为双醛化后可不必进行鞣化。首都医院做了“丙酮醛＋甲醛＋鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多数意见认为醛化后仍需鞣化比较好。
(1) 鞣化过程：①将10％醛化红血球用生理盐水洗涤2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗涤1次，最后以PBS配成2.50％悬液；②称取优质鞣酸20mg，以生理盐水4ml配成1﹕200的浓度，于37℃水浴，使之充分溶解，然后再以pH7.2PBS稀释成1﹕2 000的浓度。当天配制、当天用完；③1份2.5％红血球悬液与1份1﹕2 000鞣酸液充分混合，37℃水浴10min，1 500r／min离心，去上清，用PBS液洗涤1次；④以0.02％牛血清白蛋白PBS液洗涤1次，最后以牛血清白蛋白PBS配成2.5％鞣化红血球。
（2）影响鞣化的因素：①鞣酸的质量：这是很重要的，所以必须采用优质鞣酸。分析纯的鞣酸呈面包屑状，不呈面粉状，有折光性；②鞣酸的浓度：浓度过高，可以出现红血球的凝集现象；浓度过低，达不到红血球的活化作用。醛化过的红血球所采用的鞣酸浓度一般比新鲜红血球高10倍。通常以1：2 000为佳；③鞣化时间：鞣化过程一般10min～15min即可完成。时间再长也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化时采用的pH对吸附抗原和血凝滴度影响不大，一般采用pH7.2的PBS液。
（四）红血球的致敏
  1．致敏抗原剂量的确定 一般而言，在一定的范围内，抗原的浓度与试验的敏感性呈正比，超过这个范围，再增加抗原，敏感性不会再提高，而且过大，有时会引起非特异性凝集。当采用一种新的抗原时，必须经过试验，选择适当的抗原致敏浓度，即把抗原稀释成几个不同的浓度分别致敏红血球。再用这些致敏红血球分别与标准阳性血清进行试验，与标准阳性血清呈最高滴度的阳性反应的最小抗原剂量，即为该抗原的单位计量。致敏时，根据不同的抗原，可采用2～4个单位计量进行致敏。
2．致敏方法 各种抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白质的致敏方法如下：
所需浓度的抗原           1 份
pH6.4PBS液            4 份
2.50％的鞣化红血球悬液       1 份
混匀，置37℃水浴30min，离心，沉淀后，以2.5％兔血清生理盐水洗涤1次，悬浮于1份兔血清生理盐水中。
3．影响红血球致敏的因素
  ⑴要有高纯度或高效价的抗原或抗体。
⑵被致敏抗原或抗体的适当剂量和浓度。如抗体一般以μg/ml IgG为宜。抗猪瘟IgG一般用80μg/ml～160μg/ml，抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml，抗猪水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml，抗猪肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml，抗猪弓形体20μg/ml~40μg/ml，抗原一般用0.2mg/ml～1mg/ml。
⑶pH：除鸡卵蛋白采用4.6～5.1外，其它通常采用5.6～6.4，高于7.2或低于4.6均可使红血球发生自凝。
⑷致敏温度：一般为37℃，范围是20℃～40℃。
⑸致敏时间：一般采用30min为最适时间，具有良好的特异性和重复性。也有采用60min。时间过长，会造成红血球的形态不整，反应结果紊乱等。
⑹血球浓度：一般为1％，范围为0.5％～1.5％。
（五）操作方法
可采用试管法、凹窝板法和微量法。前者稀释度准确、结果清晰、终点明确。后者具有节约材料、操作方便、结果出现迅速等优点。
试管法的供试材料用兔血清盐水二倍递减稀释，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振荡，混匀后置室温，红血球完全沉下（需数小时）或过夜后判定结果。
每次试验需做下列对照：①血清对照：最高浓度的血清＋鞣酸血球；②鞣酸血球对照：兔血清盐水＋鞣酸血球；③致敏血球对照：兔血清盐水＋致敏血球；④标准阳性血清对照：稀释已知滴度的阳性血清，加致敏血球以检验试验的敏感性是否前后一致。
（六）结果判定
＋＋＋＋：管底呈细密的颗粒凝集，边缘不整齐。
＋＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，边缘折叠。
＋＋  ：全管底呈光滑的均匀片层，如伞状。
＋   ：管底大部分复以光滑片层，边缘稍厚。
±   ：较“＋”面积更小，中央有沉积的红血球。
—   ：红血球沉积在管底中央，如小圆盘或钮扣状。
以“＋＋”为滴度终点。

五、间接血凝检测多杀性巴氏杆菌荚膜抗原

（一）材料与试剂
1．绵羊红血球
2．标准多杀性巴氏杆菌荚膜菌种A、B、D、E。
3．待测荚膜群的多杀性巴氏杆菌
4．戊二醛（G.R.）
5．pH7.2的PBS液
6．阿氏液（Alserers）
葡萄糖             2.05g
柠檬酸钠（5H2O）        0.80g
柠檬酸（H2O）         0.05g
      NaCl              0.42g
      H2O   加至         100.00ml
     混合过滤，8磅15min灭菌备用 。
（二）操作方法
1．多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的制备 在血清裂解血琼脂平板上筛选待测的多杀性巴氏杆菌荧光性典型的菌落（荧光性弱的可通过小白鼠或本动物复壮），接种于血清裂解血琼脂斜面或改良马丁汤琼脂斜面，每株接两管，于37℃培养16h左右，达融合生长后，用2ml生理盐水（每管1ml）洗下，收集于小试管中，于56℃水浴30min，然后以8 000r／min离心30min，取上清液即可。
2．红血球的醛化 无菌采取绵羊血，以阿氏液保存或以玻璃珠脱纤，用生理盐水将红血球洗涤3次，以pH 7.2 PBS配制成5％的悬液（以全血量为50％红血球计算），另将戊二醛以pH7.2PBS稀释成2.5％的溶液。
5％红血球               100ml
2.5％戊二醛溶液             20ml
混合后以磁力搅拌器室温搅拌1h，用生理盐水洗涤4次，再用pH7.2PBS液配制成50％的醛化红血球悬液（即加至原血量的体积），加1／万硫柳汞防腐，分装小瓶，置4℃保存备用。
3．红血球致敏 2ml荚膜抗原加入50％醛化红血球悬液0.20ml，充分混匀，37℃作用2h，中间轻轻振荡数次，离心去上清，再用生理盐水洗涤一次，最后加入10ml生理盐水，混匀，即为1％的致敏红血球液。
4．荚膜高免血清的制备和处理 选Cartor A、B、D、E 标准菌株分别接种于马丁琼脂斜面，37℃培养10h～18h，以灭菌生理盐水洗下，加福尔马林处理，使其达0.3％福尔马林菌液浓度为200亿／ml～300亿／ml的悬液。选一岁左右的健康绵羊作为制备荚膜高免血清用的动物。第一次皮下注射加有氢氧化铝佐剂的死菌抗原2ml，2～3周后开始用不加佐剂的死菌悬液，每周注射2次，剂量为1ml，1ml，2ml，2ml，3ml，3ml，……10ml，最后放血，常规收获血清，即为荚膜定型用高免血清。
取A、B、D、E标准荚膜高免血清 2ml，置56℃灭活30min，加入50％醛化红血球0.4ml，37℃作用2h，离心去红血球即可。
5．反应术式，见表5-2
表5-2间接血凝加样表

各成分加毕后，充分摇匀，置室温中2h～3h观察结果。
（三）结果判定
＋＋＋ ： 凝集的红血球铺得较宽，或卷边或有缺口。
＋＋  ： 凝集的红血球平铺管底，呈沙撒布。分布不均匀，边缘不整齐。
＋   ： 凝集的红血球面积较小，凝集程度轻微。
－   ： 红血球形成小而光滑的圆点或有空心。
以“＋＋”为样品的滴度终点。

六、反向间接血凝检测猪传染性水泡病病原

（一）材料与试剂
1．高免血清 以猪传染性水泡病乳鼠毒苗免疫成年猪，10天后攻毒，攻毒后蹄部发生水泡。四星期后第二次攻毒，再过二星期，放血收集血清。
2．免疫球蛋白IgG的提取 以高免血清加等量0.01Mol/l pH 7.0 PBS,逐步滴加饱和硫酸铵液使成20％饱和，静置1h，滤纸过滤，滤液加饱和硫酸铵液使成50％饱和，静置1h，离心、沉淀，加   PBS至原血清容量。以33％饱和硫酸铵沉淀3次，最后沉淀以少量PBS洗下，透析，过Sephadex G50，浓缩、透析，过DEAE－纤维素柱。洗脱液用0.0175Mol/L pH6.4PB液。收集蛋白组成，测定蛋白含量。
3．双醛固定血球 绵羊红血球，以丙酮醛、甲醛固定，固定方法见本章第四节。
4．致敏血球 以1％血球悬液，IgG以130μg/ml～160μg/ml致敏为适宜。
5．标准抗原 水泡皮磨碎，以生理盐水作1︰5～1︰10的稀释，置室温2h～3h，离心去上清。水泡液以1︰5稀释用。
6．健康猪蹄冠皮 猪口蹄疫水泡皮及水疱液。处理方法同上。
（二）操作方法
在有机玻璃板96孔V型底微量反应板上加稀释液，每孔一滴，每份样品两排孔，一排为测定孔，另一排为对照孔。以微量滴管取样品抗原材料。在测定排孔及对照排孔第一孔，各加一孔，顺序进行倍比稀释，每排最后一孔不加样品，作为空白对照。
在测定孔，加入稀释液一滴，在对照孔，加入高免血清（1︰100稀释）一滴。于微型振荡器上振荡，盖上薄片，置37℃条件下30min～60min。
在反应孔板上，每孔加入1％的致敏红血球悬液一滴，混匀置室温(25℃左右)2h左右，观察结果。
（三）结果判定