转氨酶GPT、GOT活性的测定

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转氨酶是生物体内一类非常重要的酶，其能催化α–氨基酸的α–氨基与α–酮酸的α–酮基之间的相互转化，使生成新的氨基酸与新的酮酸。这一过程称为转氨基作用。转氨作用在生物体蛋白质的合成与分解中间代谢过程中，在糖、脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系、相互制约及相互转变过程中至关重要。
在动物机体中活力最强、分布最广的转氨酶有两种：一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶(简称GOT)，另一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)。它们的催化反应如下：
此反应最终产物是丙酮酸，丙酮酸可与2，4—二硝基苯肼反应，形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色。再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出丙酮酸含量，以此测定转氨酶的活力。
丙酮酸 + 2，4—二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙(棕红色)+ 水
转氨酶的活性单位可表示为：每毫升血清与基质在37℃下作用60分钟，生成1μmol 丙酮酸为1个单位。


仪器、原料和试剂
仪器
分光光度计、水浴锅、试管及试管架、移液管等。
原料
血清
试剂
1. 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4)：称取磷酸氢二钾13.97g 和磷酸二氢钾2.69g，溶于蒸馏水，定容至1000 mL。
2. GPT 基质液：称取a-酮戊二酸29.2 mg 及DL-丙氨酸1.78g，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20mL中，溶解后再加缓冲液70mL，并移入100mL 容量瓶内。加1mol/L 的NaOH 溶液0.5mL，校正pH 至7.4。
再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100mL。贮存于冰箱备用，可用1周。
3. GOT 基质液：称取a-酮戊二酸29.2 mg 及DL-天冬氨酸2.66g，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液30mL中，溶解后再加缓冲液60mL，并移入100mL 容量瓶内。加1mol/L 的NaOH 溶液0.5mL，校正pH 至7.4。再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100mL。贮存于冰箱备用，可用1周。
4. 2，4—二硝基苯肼溶液：称取2，4—二硝基苯肼20mg，先溶于10mL 浓盐酸中(可加热助溶)，再以蒸馏水稀释至100mL(有沉渣可过滤)，棕色瓶内保存。
5. 丙酮酸标准液(2μmol/mL)：精确称取丙酮酸钠22mg，溶解后转入100mL 容量瓶中，用磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH7.4)稀释至刻度。
6. 0.4 mol/L 氢氧化钠溶液。
7. 柠檬酸苯胺溶液：取柠檬酸50g 溶于50mL 蒸馏水中，再加苯胺50mL 充分混合即成.低温出现结晶时，可置于37℃水浴中，待溶解后使用。


操作步骤
1.标准曲线制作
取6支试管按下表操作。
混匀，放置5分钟，在波长520nm 处测定，以空白调”0”点，读取吸光度。
GPT 测定不加柠檬酸苯胺溶液，其他操作方法与GOT 测定法相同。

计算
1.由所测得的光密度值直接查标准曲线，即可得活性单位。
2.若用标准管法测定，可用丙酮酸标准液( 2μmol/mL)0.1mL，按操作测知标准管吸光度，按下列
方式计算结果：
转氨酶活性(单位数)/100mL 血清 = (测定管吸光度/标准管吸光度)×200