纤维素酶活力的测定

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一、目的
学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。

二、原理
纤维素酶是一种多组分酶，包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
（1）纤维素酶制剂 500mg
（2）新华定量滤纸 50mg / 份 × 4
（3）脱脂棉花 50mg / 份 × 4
（4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg
（5）水杨酸苷 500mg
2．主要仪器
（1）722 型或其他型号的可见分光光度计
（2）恒温水浴2 台
（3）沸水浴锅
（4）电炉子
（5）剪刀
（6）万分之一分析天平
（7）恒温干燥箱
（8）冰箱
（9）试管架
（10）胶头滴管
（11）具塞刻度试管 20mL×24
（12）移液管或加液器 0.5 mL×3；2mL×7
（13）容量瓶 100 mL×6；1000 mL×3
（14）量筒 50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1
（15）烧杯 100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1
3．试剂（均为分析纯）
（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液
将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。
（3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7 · H2O（MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

B 液（0.1 mol/L 柠檬酸钠溶液）：准确称取Na3C6H5O7 · 2H2O（MW=294.12）29.412g于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中，然后用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
取上述A 液27.12mL，B 液22.88mL，充分混匀后移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀，即为0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用，用于测定滤纸酶活力。
（4）0.05 mol/L pH5.0 的柠檬酸缓冲液
取上述A 液20.5mL，B 液29.5mL，充分混匀后移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。即为0.05M pH5.0 的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用。用于测定C1 酶活力。
（5）0.51％羧甲基纤维素钠（CMC）溶液
精确称取0.51gCMC 于100mL 小烧杯中，加入适量0.05 mol/L pH5.0 的柠檬酸缓冲液，加热溶解后移入100mL 容量瓶中并用0.05 mol/L pH5.0 的柠檬酸缓冲液定容至100mL，用前充分摇匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定CX 酶活力。
（6）0.5％水杨酸苷溶液
准确称取0.5g 水杨酸苷于100mL 小烧杯中，用少量0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液溶解后，移入100mL 容量瓶中并用0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定β-葡萄糖苷酶活力。
（7）纤维素酶液的配制
准确称取纤维素酶制剂500mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，此酶液的浓度为5mg/mL，4℃冰箱中保存备用。
四、操作方法和步骤
1．葡萄糖（G）标准曲线的制作
取8 支洗净烘干的20mL 具塞刻度试管，编号后按表1 加入标准葡萄糖（G）溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。在540nm 波长下，以1 号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。
表1 葡萄糖标准曲线制作

2．滤纸酶活力的测定
取4 支洗净烘干的20mL 具塞刻度试管，编号后各加入0.5mL 酶液和1.5mL 0.05 mol/LpH4.5 的柠檬酸缓冲液，向1 号试管中加入1.5mL DNS 溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4 支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入滤纸条50mg（新华定量滤纸，约1cm × 6 cm），50℃水浴中保温1h 后取出立即向2、3、4 号试管中各加入1.5mL DNS 溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1 号试管溶液为空白对照调零点，在540nm 波长下测定2、3、4 号试管液的光密度值并记录结果。
根据3 个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力（U/g）。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

式中：5.56 为1mg 葡萄糖的μmol 数。（1 000/180=5.56）
3．C1 酶活力的测定
将5mg/mL 的原酶液稀释10～15 倍后用于测定C1 酶活力，以脱脂棉为底物。取4 支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入50mg 脱脂棉，加入1.5mL 0.05MpH5.0 的柠檬酸缓冲液，并向1 号试管中加入1.5mL DNS 溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4 支试管同时在45℃水浴中预热5～10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，45℃水浴中保温24h。取出后立即向2、3、4 号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1 号试管溶液为空白对照调零点，在540nm 波长下测定2、3、4 号试管液的光密度值并记录结果。
根据3 个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出C1 酶活力（U/g）。在上述条件下反应24h，由底物生成1μmol 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

式中：24 为酶活力定义中的24h。
4．CX 酶活力的测定
将5mg/mL 的原酶液稀释5 倍后用于测定CX 酶活力，以CMC 为底物。
取4 支洗净烘干的20mL 具塞刻度试管，编号后各加入1.5mL 0.51％CMC 柠檬酸缓冲液，并向1 号试管中加入1.5mL DNS 溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。
将4 支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入稀释5 倍后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min 后取出，立即向2、3、4 号试管中各加入1.5mL DNS 溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1 号试管溶液为空白对照调零点，在540nm 波长下测定2、3、4 号试管液的光密度值并记录结果。
根据3 个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出CX 酶活力（U/g）。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

5．β-葡萄糖苷酶活力的测定
取4 支洗净烘干的20mL 具塞刻度试管，编号后各加入1.5mL 0.5％水杨酸苷柠檬酸缓冲液，并向1 号试管中加入1.5mL DNS 溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4 支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min，取出后立即向2、3、4 号试管中各加入1.5mL DNS 溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1 号试管溶液为空白对照调零点，在540nm 波长下测定2、3、4 号试管液的光密度值并记录结果。
根据3 个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出β-葡萄糖苷酶活力（U/g）。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

五、结果计算
1．葡萄糖（G）标准曲线的制作（表2）
表2 标准曲线测定数据列表

根据表中数值，以葡萄糖（G）含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，

在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。并在坐标纸的右上角写上实验题目、时间、实验人。

2． 滤纸酶活力的测定结果计算（表3）

表3 滤纸酶活力的测定数据列表






4．CX 酶活力的测定结果计算

六、附 注
1．DNS 溶液配制时，将含DNS 的NaOH 溶液加到含酒石酸钾钠的热水溶液中时，一定要慢倒，边倒边搅拌，以防被烫。
2． 纤维素酶液的浓度可根据不同酶制剂的活力而相应调整。如果酶活力高，酶浓度可小些；反之，酶活力低时，酶浓度则大些。
3．在测定时，调零用1 号管液一定在相应的各管液测定完成后，方可从比色杯中弃掉。
4．测定酶活时，滤纸条和脱脂棉等底物一定要充分浸入在反应液中。
5．用移液管或加液器加各试剂时，不能将移液管或取液枪头混用。