RNA甲醛变性凝胶电泳和转膜

yujian623

从组织或细胞中提取出来的核酸（DNA/RNA）经琼脂糖凝胶电泳将其按分子量的大小分离，然后将其转移到固相支持物上（如：硝酸纤维素膜），用被标记的已知核酸片断（探针）对固相支持物上的待检测核酸进行检测（杂交）。
一、RNA电泳（甲醛变性电泳）
【目的】 将DNA/RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来，通过加入标准核酸分子（markers）对其进行鉴定，并用于转膜、杂交等。

【试剂】
10×MOPS缓冲液：
   0.2mol/L MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸）
   80mmol/L NaAc
   10mmol/L EDTANa2
  先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS和4.1gNaAc后，加入10ml 0.5mol/L EDTA，定容500ml。用0.22mm滤器过滤除菌，避光保存。
1×MOPS电泳缓冲液：
     10×MOPS   150ml
     37%甲醛    80ml
     加水至1500ml。
甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液（10×）：
    50％甘油
    1mmol/L EDTA
    0.25％溴酚蓝
    0.25％二甲苯青FF
  5ml甘油、20ml 0.5mol/L EDTA、25mg溴酚蓝、25mg二甲苯青FF，加DEPC水至10ml，高压后，4°C保存。
5mol/L EDTA（pH8.0）
37％甲醛、甲酰胺等。

【操作步骤】
1． 电泳槽用0.3%H2O2浸泡30min，DEPC水冲洗晾干。
2． 铺胶（20ml）
琼脂糖     0.24g （1.2%）
无RNase水   17.4ml
10×MOPS    2.0ml
37%甲醛     0.6ml
EB        1ml
  将琼脂糖加水融化后，加10×MOPS，待胶冷却至60°C左右，再加甲醛和EB。（若铺大胶可将上述各试剂的量加大2倍）。
3． RNA样品处理（以一条泳道为例）
  
4．加2.0ml甲醛凝胶加样缓冲液（10×）
5．加样和电泳
  将凝胶预电泳5min，电压降为5v/cm。随后加样品和标准物，以3－4v/cm电压降电泳，电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处。
6． 电泳结束后，在紫外灯下，仔细测量28S rRNA和18S rRNA至加样孔的距离，并同荧光尺一起拍照，以记录标准物的位置。

【注意事项】
1． 每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）；如待测RNA含量极微，每个泳道加0.5-3.0mg poly(A)+ RNA。
2． 标准物28S rRNA