细胞生长曲线的绘制

yujian623

.取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105个/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。按200μl/孔（1×104个细胞）接种于96孔培养板内，每组细胞接种5个孔，取平均值，切记各孔的接种密度一致。
2.置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养，
3.用PBS配制5mg/ml的MTT溶液，0.22微膜过滤除菌，4度保存。(MTT溶剂需避光4度保存，配好的溶剂有效期两周，过期的不能再用于实验，须重配)
4.从第24 h开始，每隔24 h随机取1块96孔板，96孔板每孔加入20μl 5mg/mL MTT液，继续培养4 h后，吸出孔内培养液；向每孔加入150μl DMSO。将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。
5.酶联免疫检测仪检测各孔OD值，检测波长570 nm, 以时间为横坐标，平均OD值为纵坐标，记录并绘制细胞生长曲线。
备注：
A.选择适当的细胞接种浓度。因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。
B.细胞生长曲线方法96孔板太小,接种细胞多时,用不了几天就长满,因一般要做5-7天);接种细胞少时,不易养活.
C.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高浓度的血清物质会影响试验孔的吸光值。由于试验本底增加，会降低试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
D.操作过程中按常规换液.一般2-3天换液,如果不换液,则酸性产物等代谢产物积聚,一方面培养环境改变影响细胞生长,另一方面细胞营养消耗过多,生长变慢.做细胞生长曲线的目的是反映其生长特性,增殖能力,不换液则与我们平时细胞生长环境不一致.结果不科学.
E.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。