凝集反应试验总结

yujian623

凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。即可用已知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。
一．直接凝集反应
颗粒抗原与抗体直接结合出现凝集现象叫直接凝集反应。
（一）  玻片凝集反应
材料：
1．诊断血清：1：10稀释的伤寒杆菌诊断血清
2．菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌24小时琼脂斜面培养物
3．生理盐水、载玻片、毛细吸管
方法：
1．取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1：10稀释伤寒杆菌诊断血清1-2滴，第三格加1-2滴生理盐水。
2．无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。
3．同法取枯草杆菌培养物少许，于第二格内混匀。
4．轻轻摇动玻片，经1-2分钟后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为平等的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。
（二）  试管凝集反应
为一种定量试验，用已知抗原检查血清中有无特异抗体，并测定其相对含量。
材料：
1．诊断血清1：10稀释伤寒杆菌“H”血清，1：10稀释伤寒杆菌“O”血清。
2．菌液：伤寒杆菌“H”菌液，伤寒杆菌“O” 菌液。
3．生理盐水，小试管，吸管。
方法：
1．取洁净小试管14只分两排排列于试管架上，每排7只依次用蜡笔注明号码，于每管中分别加入0.5毫升生理盐水。
2．在第1排1管中加入1：10稀释伤寒H血清0.5毫升，于管内连续吹吸3次，使血清与盐水充分混合，而后吸出0.5毫升注入第2管，同样予以混匀后吸出0.5毫升注入第3管。依次类推，稀释到第6管，自第6管吸出0.5毫升弃去。此时，自第1管至第6管的血清稀释倍数为1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。第7管不加血清作为对照。
3．同法用吸管吸取1：10稀释伤寒杆菌O血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀释。
4．用移液管吸取伤寒杆菌H菌液，加收第1排各管中每管0.5毫升（由盐水对照管开始，依次由后向前加入）此时血清稀释倍数又增加了一倍。
5．同法于第2排各管中加入伤寒O菌液0.5毫升。
6．将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2—4小时或37℃孵育箱中过夜次日取出观察结果。
观察结果：
1．观察切勿摇动试管，以免凝集块分散。
2．先看对照管，此管应无凝集现象，管内液体仍成混浊状态。但如放置时间较长，细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反应。
3．试验管应自第1管看起，如有凝集时则于管底有不同大小的圆片状边缘不整齐的凝集物，上清则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用“+”号表示如下：
“++++”凝集很强，管内液体完全澄清，凝集块完全沉于管底；
“+++”凝集强，管内液体不完全澄清稍有轻度混浊，凝集块沉于管底；
“++”凝集中等强度，液体半澄清，凝集块沉于管底；
“+”凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底；
“－”不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。
4．轻轻振荡各管，观察凝集块的状态，对照管的细菌在振荡时呈烟雾状上升，随即消散，细菌分散仍呈混浊状态。“H”菌液的凝集块疏松呈棉状，大片沉于管底轻摇即升起，并极易破碎。“O”菌液凝集呈紧密颗粒状，沉于管底坚实致密，轻轻振摇不易升起，凝集颗粒较小不易摇碎。
5．记录观察的结果并制定凝集效价。通常以能产生明显凝集（++）的血清大稀释倍数作为该血清的凝集效价。如血清的最低稀释度（即第1管1：40）仍无凝集应报告为低于1：40。如血清的最高稀释度（即第6管1：1280）仍显完全凝集现象。，应报该血清效价高于1：1280。
二．间接凝集反应
将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上，然后与相应的抗体结合，也可出现颗粒载体的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性为高，可用于微量抗体或抗原的检查。
（一）  间接血球凝集试验
间接血球凝集试验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的。将细菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面，此时红血球即称为“致敏红血球”。这种致敏的红血球具有细菌的抗原性，与相应的抗血清相遇可产生凝集现象。
间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸出，去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的红血球需先用鞣酸予以处理。
材料：
1．抗原—伤寒杆菌O抗原
2．免疫血清：伤寒杆菌O901免疫兔血清
3．25%绵羊红血球悬液，生理盐水，试管吸管等
方法：
1．“O”抗原的制备：
将每毫升100亿的伤寒杆菌“O”菌悬液，置100℃水浴中2小时，离心沉淀吸取上清夜，分装无菌试管，放4℃冰箱备用。
2．致敏红血球悬液制备：
取一定稀释度的抗原加等量2.5%绵羊红血球悬液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分钟取出振摇一次，共经2小时。然后取出，用生理盐水洗涤3次，而配制成0.5%悬液即成。
3．试验步骤：
（1）小试管9只标好号码于试管架上。
（2）第1管加入0.9毫升生理盐水，其余各管各加入0.5毫升。
（3）以吸管吸取已加热灭菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混匀后吸取0.5毫升注入第2管，同样第2管的血清与盐水混匀后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀释直至第8管。自第8管吸出0.5毫升弃去。第9管不加血清作对照。
（4）于每管加入0.5毫升已经致敏的0.5%绵羊红血球悬液，混匀后放入37℃水浴中2小时后观察结果。凡最高血清稀释度的免疫血清试管中呈现完全血凝者，即为该血清的间接血清效价。
（二）  间接凝集抑制试验
若使可溶性抗原与相应抗体先混合，充分作用后再加入有关的免疫微球，因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现免疫微球的被动凝集现象，叫间接凝集抑制试验，临床化验检查中常用的免疫妊娠试验就是一种间接凝集抑制试验。
妊娠试验：
孕妇尿中绒毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此当往尿中加入抗绒毛膜促性腺激素抗体时，由于发生抗原抗体反应的结果，抗体被消耗，此时再往尿中加入胶乳抗原（吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳胶颗粒）。不发生反应，抗原仍呈乳状液体，即为妊娠试验阳性。反之，被检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗体消耗，当胶乳抗原加入后，抗体便与抗原结合发生反应。出现均匀细小颗粒，妊娠试验为阴性。

材料：
1．抗原：吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原
2．抗体：抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清
3．被检材料：孕妇尿
4．正常尿作对照用
5．黑反应板1块
6．滴管3只
方法：
1．用清洁滴管在反应板上滴加一滴被检尿。
2．再往尿滴加抗血清一滴，轻轻摇动，充分混匀。
3．滴加一滴胶乳抗原，缓慢摇动3—5分钟，在较强光线下，观察结果。出现均匀一致的细小颗粒为阴性反应，怀孕。
注意事项：
1．试验材料用具用前使温度接近室温（20℃左右）
2．被检尿太混浊，需要小心过滤。
3．尿中有蛋白及血液时，不宜进行此试验。
（三）  协同凝集试验
金黄色葡萄球菌细胞壁成分中的A蛋白能与人及多种哺乳动物（猪、兔、羊、鼠等）血清中IgG类抗体 的Fc段结合。IgG的Fe段与SpA结合后，两个Fab段暴露在葡萄球体表面，仍保持其抗体活性和特异性当其与特异性抗原相遇时，也出现特异凝集现象。在以凝集反应中，金黄色葡萄球菌菌体成了IgG抗体的载体,称为协同凝集反应.本反应也可用于检测微量抗原.
A.  材料：
1.  抗原:可溶性伤寒杆菌O抗原
2.  免疫血清：伤寒杆菌0901免疫兔血清
3.  10%CoWan1株金黄色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液
4.  PBS0.5%甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等
B.  方法：
1．10%葡萄球菌菌悬液的制备：CoWan1株葡萄球菌接种于柯氏瓶，37℃培养18-24小时，用PBS洗下菌苔，每分钟2500转速度离心20分钟。沉淀菌用PBS洗两次后，用0.5%甲醛（用PBS配置）在室温中固定3小时。置于80℃水浴中4分钟以破坏菌体的自源性分解酶。再用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。
2．致敏葡萄球菌：
1毫升10%的菌悬液加0.1毫升伤寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中30分钟（中间需摇动两次）。取出后经每分钟2500转速度离心20分钟，弃去上清液，沉淀菌用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。
3．协同凝集试验
取伤寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌悬液，一滴在载波片上混匀，观察约2分钟。一般在几秒钟内即可发生凝集。
滴一滴致敏葡萄球菌悬液于玻片上，用接种环取伤寒O菌培养物少许置于悬液中使成均匀孔状，观察约2分钟，记录有无凝集。
用伤寒“O”杆菌培养物与未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾杆菌培养物与致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均为阴性反应，不出现凝集。
三．凝集吸收
肠道杆菌中的许多细菌都有部分相同的抗原结构。因之一种细菌可与另一种细菌相应的抗血清发生交叉凝集反应。用一种过量的细菌抗原与发生交叉凝集反应的抗血清相结合。可将其共同抗体吸去，剩下抗体只能与特异性抗原起反应，这种试验即称凝集吸收试验。
利用凝集吸收试验可制备单价因子血清，以进行细菌抗原结构的分析及鉴定菌型。
材料：
1.  免疫血清：1：10稀释伤寒杆菌免疫血清。
2.  菌液：肠炎杆菌菌液，伤寒杆菌菌液。
3.  试管、吸管、毛细吸管。
方法：
1.  1/10稀释伤寒杆菌免疫血清分别与肠炎杆菌与伤寒杆菌进行玻片凝集，可见伤寒免疫血清与两种菌均有凝集，说明二菌具有共同抗原结构，故发生交叉凝集反应。
2.  将一定量的肠炎杆菌菌液加入1：10稀释伤寒杆菌免疫血清中，放37℃水浴箱中作用2小时，取出后离心沉淀，吸取上清夜，弃去沉淀。
3.  将吸收过的上清夜与稀释肠炎杆菌菌液做玻片凝集，观察结果。如仍有凝集时则将此上清夜再加浓肠炎杆菌菌液进行吸收，方法如上。
4.  重复吸收过的上清夜分别与稀释肠炎杆菌及伤寒杆菌菌液进行玻片凝集。如与前者无凝集而与后者有凝集，则表示伤寒杆菌免疫血清中的抗肠炎抗体已被完全吸收。