细胞分离技术

yujian623

一、从原代组织中分离细胞 将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。

从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。

1.胰蛋白酶 (Trypsin)
●在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。
●将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25％溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。
●在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
●移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
●在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
●通过无菌不锈钢丝网（100～200mm）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。

2.胶原酶 (Collagenase)
●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。
●加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）。
●在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。
●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
●通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

3.Dispase
●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
●加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）
●在37℃孵育20分钟到几个小时。
●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。
●通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。
●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

二、从原培养容器中分离细胞 以下是从基层迅速分离细胞，且保持细胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用，每一种系统最佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。
●再次培养时检测细胞的活性。
●细胞的活率应该超过90％
●对于无血清培养基，降低胰蛋白酶使用量。

1. 移弃使用过的细胞培养基。

2. 使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗细胞（看表确定正确的清洗溶液）。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。

3. 以2～3ml/25cm驳牧浚?友≡竦姆掷胍