心肌肌钙蛋白检测方法(原创)

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前言
  心肌肌钙蛋白（CTn）是存在于心肌肌原纤维中细肌丝上的收缩调节蛋白，主要调节心肌收缩过程中粗、细肌丝之间的相对滑行。CTn含三个亚单位：肌钙蛋白 I(CTnI) 、肌钙蛋白T(CTnT)和肌钙蛋白C(CTnC) 。其亚单位和在心肌受损时可释放至细胞外，并可在外周血中检测出来。以往对一些心血管疾患时心肌受损的检测多依赖于肌酸淋酸激酶同工酶( CK-MB)的升高，尤其在急性心梗(AMI)的诊断上，应用非常广泛，但CK-MB并非心肌绝对特异性酶，在骨骼肌中亦有存在，其在骨骼肌损伤和一些非心脏手术患者中常会升高，给心肌损伤的判断带来一定的困难。自1987年Cummins首次报道了以周围血中来诊断AMI，临床对 CTn的研究越来越多。发现其对心肌损伤的敏感性和特异性均优于CM-MB。
1  CTnT 的检测方法
CTnT在血液中出现的时间早于 CK-MB，稍迟于肌红蛋白，其在血浆中半衰期是120分钟，CTnT在血中正常含量很低，在正常人血浆中的浓度是0.18ug/L，高于0.5ug/L即提示心肌细胞损伤，因此测定方法需要很低的可测限和较高的灵敏度。CTnT的ELISA分析法最早始于1989年，其理论基础是亲和纯的一种多抗和一种单抗而建立起来的，以后又发展了更敏感特异的单抗一步法ELISA。
1.1 第一代CTnT ELISA分析法  第一代CTnT ELISA分析法商品化试剂于1992年进入市场，其固相采用链霉亲和素（Strptavidn SA）包被的聚苯乙烯管，第一单抗用生物素（biotinB）标记，通过B_SA反应间接包被在固相上，第二抗体用辣根过氧化物酶标记，两者与标本中的CTnT形成双抗夹心，整个反应需要90min完成，其敏感性较最早的ELISA法高5倍，并且由于全部采用单抗，其检测结果重复性较高。但临床资料表明，患有严重骨骼肌损伤的病人和晚期肾病的病人CTnT会产生假阳性。这是由于检测方法的交叉反应和 CTnT在骨骼肌中的重表达所致。
1.2 第二代CTnT ELISA分析法  第二代CTnT ELISA商品化试剂于1997年问世，它具有更高的敏感性和特异性，该法不会因为CTnT在晚期肾脏病病人骨骼肌中的重表达而产生假阳性，从而排除了分析法的交叉反应。并且其检测时间由原来的90min降低到45min，目前临床已由第二代取代了第一代。
1.3 第三代CTnT ELISA分析法  第三代CTnT分析法生产试剂也于最近，进入市场，它运用重组人基因代替了第二代分析法中的牛血清，其灵敏度和特异性均优于第二代，并且分析时间更快，缩短到20min以内。
1.4  CTnT的快速检测法  用于检测CTnT的快速诊断试剂盒已经问世，金免疫层析法是目前较理想的快速测定试验，以德国Bhoehringer Mannheim公司的CARDIAC_T实验板为例，试验为两种特异的单克隆抗体，一种金标记，一种生物素标记，抗体与标本中的CTnT形成夹心复合物，测定区形成红色色带为阳性，并可根据色带深度，通过光学系统，可以定量测定CTnT。该法与CTnT ELISA法之间有较好的相关性（r=0.98; у=0.85х+0.002）
2  CTnI 的检测方法
CTnI的测定始于20世纪80年代中期，最早使用多克隆抗体检测的放射免疫法，随后相继出现了运用单克隆抗体检测的各种不同的酶免疫法。若实验中所用的抗体为多克隆抗体，会交叉反应，且灵敏性差。单克隆双抗体夹心放免法和双抗体夹心ELISA法使测定灵敏度大大提高，测定低限为0.1~0.2μg .L-1，目前CTnI测定多采用化学发光法，该法提高了测定的精确度和敏感性。
2.1  CTnI的夹心免疫放射法  该法测定的原理是应用识别抗原不同位点的两个单克隆抗体（mcAb）作双抗体夹心法测定，她首先将一个mcAb于固相载体联结形成固相mcAb复合物，同时加入待测标本和酶标mcAb，形成双抗体夹心，再加入荧光底物显色。运用较多的有Stratus法，该法是一种先进的自动双位点荧光酶免疫定量检测法，特异性高，灵敏度为0.35μg .L-1，检测时间为10min。
2.2  CTnI的夹心酶联免疫法  该法是以包被固相载体的特异性抗体为第一抗体，加入待测血清后，再加入生物素标记的第二抗体，形成双夹心，孵育后冲洗分离，加入发光基质底物,测得的光强度与标准曲线相比可得CTnI的浓度值。目前运用较多的有全自动磁微粒子化学发光酶联免疫分析仪定量测定CTnI,样品中的CTnI与包被于磁微粒子上的鼠抗人CTnI特异性McAb结合,再加入标记碱性磷酸酶的鼠抗人CTnI第二抗体,孵育后在磁场中冲洗分离,加入发光基质底物AMPPD,测发光强度,光强度与CTnI含量成正比,其灵敏度为0.1μg .L-1。
国外报道的CTnI测定中,较先进的有利用生物学技术中的杂交瘤技术制备抗CtnI单克隆抗体特异性细胞株,其准确度达100%。国内还没有该技术,国外尚处于试用阶段。
2.3  CTnI 的固相免疫层析法  该法是一种定性检测CTnI的方法,实验装置中包括一个包被了CTnI抗体的膜体,膜条为包含一个显示窗以及一个加样孔,显示窗上半部为对照区,下半部为试验区,若显示窗内有两条明显的粉红色_紫色线条说明有存在,检测时间15 min。
3  CTnT 和CTnI的临床意义
CTnT和CTnI对的AMI的诊断都有敏感性高,特异性强,持续时间长等优点。但是许多临床研究发现,在升高倍数和持续时间上CTnT优于CTnI,因为CTnT在正常人血中含量很低,在心肌细胞中含量高,如果少量释放,血清中的CTnT含量可数倍甚至数十倍升高,AMI时可增加30~200倍,而CTnI为10~20倍,CTnT在血液和淋巴液中消除速率慢,AMI时可升高达2~3周,CTnT较CTnI持续时间长,但是CTnT与骨骼肌会发生交叉反应,严重骨骼肌受损的患者CTnT可出现假阳性反应,并且肾功能衰竭和多发性肌炎的患者CTnT也会升高,但CTnI与骨骼肌无交叉反应,故在诊断特异性上CTnI优于CTnT。
CTn被认为是目前最有心脏特异性的心肌受损生化标志物,在心肌坏死的新标志物中,CTn具有最宽的诊断窗口,目前FDA批准的CTn检测试剂生产厂商至少有8家,这些厂家生产的试剂测定CTn结果间存在很大的差异,最大的可相差30倍,这对临床工作的开展带来很大的不便,所以寻找一种标准化方法已非常必要,CTn测定的标准化问题主要包括:建立优化和标准的方法,开发和评估参考品以及最后测出合适的参考范围和判断值.
目前Missov等正在应用新一代高灵敏度测定CTn的免疫学方法,其检出限为0.003ug/L,大约小于现在同一公司的免疫分析系统的商品方法的几十倍。他们研究发现,对充血性心衰的患者和正常人比较,CTn有实质性改变,但这些改变值用普通方法检测不出,从上述例子看出,提高CTn检测的灵敏度对于严重心脏病的发病的病理生理机制研究很有拓展领域。
CTn作为特异性诊断标志物已受到国内外学者的广泛认可,目前发现,CTn在以下领域有一定的诊断价值：①预测心肌梗塞面积的研究；②对心肌梗塞溶栓治疗的意义；③ 对AMI和不稳定心绞痛预后判定的意义；④ CTN还可用于围手术期心肌损伤的判定。  
参考文献
1 朱德生，李华，向润娥，解晓明，柯萨奇B3病毒mAb对心肌细胞形态及多种酶代谢的影响，第四军医大学学报，2002 （23 ）3：32~35
2 王兴元，贾国良，张清，王海昌等人，冠状动脉支架置入后肌钙蛋白-I水平同冠状动脉粥样硬化斑块负荷有关，第四军医大学学报，2002（ 23 ）7：23~25
3 张小宁，于文彬，陈云春，苏明权等人，冠状动脉支架植入术对血清肌钙蛋白I的影响，第四军医大学学报，2002 （23） 17：44~48
4 邓长金，张金枝 ，肌钙蛋白Ⅰ对不稳定型心绞痛患者预后判断的价值，心血管康复医学，2001，（10）1 ：22~24
5 齐志宏，刘振元，心肌肌钙蛋白T与急性冠状动脉综合征，心血管病学进展，2001，（ 22 ）3 ：34~37
6 刘金明，刘凡，王秉臣，冯玉宝等人，心肌钙蛋白T对肺动脉栓塞患者预后评价，心血管病学进展，2001，（ 22 ）2：33~35
7  程斌，沈晓丽，许春萱，林立芳等人，射频消融后心脏肌钙蛋白Ⅰ测定与心肌损伤的关系，临床心血管病杂志，1998，2：44~47
8 周海鹰，韩秀珍，马丽霞，刘春雨等人，心肌肌钙蛋白I对小儿心肌炎的诊断价值及与肌酸激酶同功酶MB的对比研究，中国综合临床，2002 （18 ）1：12~14
9 邓大中，陈玉川，胡丙杰，蔡明屈 ，大鼠早期心肌缺血心肌肌钙蛋白T脱失的免疫组化研究，法医学杂志，2002（ 18） 1：15~19
10 李秀伟，姜坤 ，肌红蛋白和肌钙蛋白Ⅰ两种试剂盒对急性心肌梗塞的早期诊断价值，中国微循环，2002 （6） 1 ：28~31
11 何贵新 ，不稳定型心绞痛患者血清肌钙蛋白工测定临床意义的探讨，广西医学，2002 （24 ）1：19~22
12 孙剑，钱龙，王均乐，儿童心内直视手术中监测血清心肌肌钙蛋白Ⅰ的临床应用价值，江苏医药
，2002 （28 ）2：43~45
13 李晓英，何进喜，刘志军，肌钙蛋白Ⅰ对急性心肌梗死的诊断价值，宁夏医学杂志，2002 （24 ）2：34~36
14  杨振华，肌钙蛋白和循证医学，医学检验网
15 潘柏申，肌钙蛋白I的生化特点及其影响测定的因素，医学检验网
16 杨振华，潘柏申，许俊堂，心肌标志物应用准则，医学检验网
17 唐褶达，心脏肌钙蛋白I的三种检测方法对急性冠状动脉综合征危险性分层的临床价值，医学检验网
18 Katus HA et al.In traccellular compartmentation of Cardiac troponin T and its realetics kinetics in patients with reperfusedand noreperfused myocardial infaraction Am J cardial 1991.67.1360
19 Wong ss.strategic utilization of cardiac makers for the diagnostic of acute myocardial infaraction Annal clin Biochem,1996.26:301