RT-PCR相关

一、组织抽提：
1.    取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末
2.    移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆
3.    移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打
4.    冰上孵育5分钟
5.    离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管
6.    加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟
7.    离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管
8.    加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟
9.    离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液
10.    加入1 ml 75%乙醇，震荡
11.    离心<7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液
12.    室温下使之变透明
13.    加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）
14.    走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度
二、RT反应体系（第一步）：约20分钟
RNA  抽提物    5μl
Radome 引物    2μl
RNA sin    0.5μl
1.    65℃ 15分钟
2.    立即放入冰浴
RT反应体系（第二步）：约2小时
RNA sin    0.5μl
10mM dNTP    1μl
5×RT 缓冲液    4μl
25mM MgCl2    4μl
AMV 逆转录酶    3μl
1.    37℃ 1.5小时
2.    94℃ 5-10分钟
3.    反应物保存于-20℃或进行PCR
三1、PCR反应体系：约4.5小时
25mM MgCl2    2μl
10×PCR 缓冲液    5μl
10mM dNTP    1μl
上下游引物10pmol/μl    2.5μl×2
CDNA模板    2.5μl
ddH2O    34μl
Taq酶    0.5μl
轻质石蜡油    50μl
   100μl
1.    94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环
2.    94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环
3.    72℃ 10分钟
4.    取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
三2、PCR反应体系：约5小时
25mM MgCl2    3μl
10×PCR 缓冲液    5μl
10mM dNTP    1μl
上下游引物10pmol/μl    2.5μl×2
CDNA模板    5μl
ddH2O    30μl
Taq酶    1μl
轻质石蜡油    50μl
   100μl
1.    94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环
2.    94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环
3.    72℃ 10分钟
4.    取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
四、电泳：约1.25小时
1.    配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml
2.    胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）
3.    微波炉中火2分钟溶解胶
4.    冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）
5.    放入梳子，浇板，待凝固
6.    加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰
7.    电泳50-80V（每㎝ 5V）