基因免疫

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Wloff在实验中意外发现给小鼠的肌细胞注射未加任何化学试剂的质粒DNA时，发现肌细胞吸收了质粒DNA并高水平地表达了外源基因。Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠表皮细胞，在小鼠血中检测到了特异的抗生长激素抗体，并且在给予加强剂量质粒后可使免疫反应增强。此外，在其他许多动物中都观察到了外源基因的表达并被机体的免疫系统识别并激发了免疫应答。这些研究都表明直接给动物接种编码抗原的基因可使动物获得对该抗原的免疫力。
1 DNA免疫的免疫原的组成结构
DNA疫苗由病原微生物保护性抗原编码基因和作为真核表达载体的质粒构成[9]。保护性抗原编码基因可以是一组基因，也可以是单基因的cDNA，还可以利用关键性抗原表位的一段碱基序列，它们能够诱发保护性免疫反应。在质粒表达载体中，最近发现氨苄西林抗性选择基因比其他抗性选择基因能够更好地诱导免疫反应。研究表明是因为氨苄西林抗性选择基因中包含有回文结构：5'-AACGTT-3'。该结构被证明能够单核细胞产生白细胞介素12，刺激细胞分泌干扰素，增强NK细胞的活性，所以又称为单链免疫刺激DNA序列。此结果也证明了质粒表达载体在DNA疫苗中的重要性。为以后的DNA疫苗应用提供了更有利的信息。在质粒表达载体中的又一个重要的因素是启动子的类型。在多数的DNA疫苗中，源于CMV的启动子应用的最多，表现效果也最好。源于RSV的启动子功能亦较强。SV40的启动子功能最低。强启动子可以产生较好的免疫应答，但弱启动子可能诱导长期的持续性免疫应答。另外将细胞因子(白细胞介素2，12和GM-CSF或TCA3等)与外源基因融合或非融合表达，也能够增强免疫应答。
2关于DNA免疫的免疫机理，到目前为止还不十分清楚。综合各种论述，其
免疫机理主要可以归纳为：
　　 对于直接DNA疫苗接种而引起的免疫反应的分子和细胞机制的研究还刚刚开始，在大多数DNA免疫中，质粒DNA被直接接种到肌肉和皮肤，抗原在骨骼肌细胞中或在角质细胞中表达。对于传统免疫方法来说，是由那些骨髓来源的“专业”抗原递呈细胞来启动免疫应答，然而DNA免疫的成功使人们怀疑骨骼肌细胞或角质细胞也能把抗原递呈给免疫系统，那么可能的机制为：首先当质粒DNA被通过某一方式转运到靶位点后淋巴细胞或血液淋巴液将质粒DNA或其表达的抗原运送到淋巴结，转运抗原到淋巴结的细胞包括直接被转染的淋巴细胞和从转染的肌细胞或皮肤细胞获得抗原的淋巴细胞，抗原递呈在淋巴组织内进行。幼稚的抗原特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞转变为记忆细胞和效应细胞。抗体反应产生后，生发中心形成，这些有利于从幼稚B淋巴细胞产生低亲合力抗体到成熟B细胞产生高合力抗体的高变和成熟过程。新形成的生发中心，也利于抗原一抗体复合物在囊泡状的树突状细胞的沉积。抗原抗体复合物中抗原的存在，使得机体保持长期的免疫力，B淋巴细胞以记忆性或效应性细胞存在。记忆细胞在体内循环，效应细胞首先在骨髓中定植。CTL反应以记忆细胞形式存在。T淋巴细胞产生淋巴因子，促使CTL和抗体反应，Th1产生γ干扰素和白细胞介素2(IL-2)，Th2产生IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，这些淋巴因子调控免疫球蛋白的重链重排，决定补体依赖性抗体产生。辅助T淋巴细胞还会影响到由于外来感染而激活的非抗原特异性免疫，Th1淋巴因子趋化激活巨噬细胞通过释放毒素来杀伤入侵病原体，还与超敏反应和寄生虫的控制有关。
3 影响DNA免疫效果的因素
（1）质粒载体和启动子的选择
　 真核表达质粒是核酸疫苗的主体，表达载体表达抗原蛋白的能力越强，诱发宿主产生的免疫应答能力越强。不同类型的启动子/增强子、内含子序列、翻译起始序列、转录终止序列、mRNA的稳定性等调控元件可直接影响基因表达效率，其中启动子是影响核酸疫苗表达的最重要因素。RSV启动子/增强子的表达水平比SV高1000倍，CMV启动子/增强子的表达水平又比RSV高２倍。一般认为CMV是最理想的启动子。强启动子可以产生较好的免疫应答，但弱启动子可能诱导长期的持续性免疫应答。总之，要求用作核酸疫苗的载体必须具备以下特点：在哺乳动物细胞内能高水平的表达目的基因；本身不复制；不会整合到宿主染色体中。
（2） 注射途径与方法
　　核酸疫苗免疫接种的方法[6][7][8]主要分为三种：①可产生高转染效率的途径，如肌肉接种；②转染效率虽不高，但是经常被用于实验动物接种的途径，如皮下、腹腔内接种；③转染效率不高，但有高水平的局部免疫监视，如皮肤、呼吸道接种。一般地，用注射器直接注射要求DNA为10-200μg，用基因枪注射要求的DNA量可少至亚纳克级。Frnan用50-100μg甲型流感病毒血凝素（HA）基因的纯DNA于０及４周各接种一次小鼠，比较了不同的注射途径和方法对核酸疫苗的免疫效果的影响。结果发现静脉内、腹腔内和肌肉内合并免疫及单独肌肉内、静脉内、鼻腔内、皮内、腹腔内和皮下免疫的各组存活率分别为95%、95%、83%、76%、75%、67%和0。说明多种途径合并注射免疫效果最好，其它依次为肌肉内、静脉内、鼻腔内、皮内和皮下接种。随着技术的发展，目前最为有效的核酸疫苗免疫途径是使用基因枪将ＤＮＡ包被的金颗粒注入表皮。这种方法只需比普通注射法低2-3个数量级的DNA，即0.4μgDNA免疫2次即可产生95%的保护作用。Hui等首先报道了基因枪转染法诱导细胞介导的免疫应答。他们以1-2Kb MHC抗原基因通过外科手术暴露小鼠靶细胞后进行肌肉或脾内接种，结果产生了同样特异的CTL应答。基因枪技术使有效的转染与有效的抗原提呈和识别相结合。DNA包被的金颗粒射入表皮后，DNA随之提呈细胞（APC）。此外，一些学者报道，用无针喷气注射器的免疫效果明显，优于常规注射器免疫。这种装置以压缩空气驱动活塞，高压下使接种物形成细流而穿过组织。临床上已被用于肌注传统疫苗及皮下接种药物（胰岛素）。以此法注射含报告基因的质粒后可测出报告基因的表达，虽然仅及肌注表达水平的1/10，但能同时产生针对抗原的抗体和CTL。
（3）接种部位的预处理
　　 Davis等报告，试验组小鼠免疫前肌肉注射100μL 10mmol/L心肌毒素，对照组注射高渗蔗糖（25%w/v，用PBS溶解），然后两组分别接种等量HBSAgDNA疫苗。结果试验组抗～HBS水平较对照组高10倍以上。Danko等报告，在DNA接种前７天注射0.5-0.75%丁哌卡可使外源基因的表达提高40倍以上，它能选择性地破坏肌细胞，引起肌细胞再生，而再生肌细胞表达外源DNA的能力高于成熟肌细胞。
（4）接种剂量与次数
　　核酸疫苗的特点是在体内的表达量低，但是持续时间长。核酸疫苗在动物或临床试验中的免疫程序一般都是3次，大动物或人体的接种量一般为500-1000μg。多数加强免疫在小动物中可以达到增强免疫应答和获得理想免疫保护效果的目的。Ulmer等报告，给小鼠分别注射1-100μg甲型流感病毒HA或NP DNA疫苗，结果抗～HA和抗～NP水平与接种剂量呈正相关。
（5）免疫佐剂
　　免疫佐剂指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答类型的物质，包括无机佐剂（如氢氧化铝）、有机佐剂（如脂多糖、分支杆菌）及合成佐剂。近年来随着细胞因子研究的进展，发现许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效应，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括IL-１、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、 IL-12[9]等。Weiner等[10]用包含cpG序列（质粒骨架中含cpG序列）的DNA作为免疫佐剂和一种淋巴瘤抗原共同免疫小鼠，发现免疫后小鼠能抵抗攻毒试验，而且cpG佐剂的毒性远低于完全福氏佐剂，另外，cpG佐剂也能显著提高抗肿瘤单克隆抗体在小鼠中的抗肿瘤效果。近年来发现细菌DNA本身也是一种免疫佐剂，可有效地激活免疫效应细胞介导这一作用是一类具有特征性的短核苷酸序列，被称为免疫刺激DNA序列（ISS序列）。ISS的发现以及对其生物学功能研究的不断深入，扩展了人们对DNA生物学的新认识。有学者认为，对ISS的研究有望提供一种高效、低毒、适用于人类及动物的新型佐剂。