[工业指南]药物研发过程中药物代谢和药物相互作用的体外研究

huzhoulyc

Ⅰ. 简介
药物进入体内以后，一般经过两种途径进行消除：直接排泄或者代谢成为一种或几种活性的或非活性的代谢产物。当药物主要通过代谢进行消除时，那么它的代谢途径会显著影响药物的安全性、有效性及使用方法。如果药物仅由一种代谢途径进行消除，那么代谢速率的个体差异能导致血和组织中的药物和代谢物浓度的极大差异。一些例子表明，差异呈现具有遗传多态性特征的双相分布（如CYP450 2D6，CYP450 2C19，N-乙酰转移酶）。当遗传多态性影响一条重要的药物消除途径时，为了达到安全有效地使用药物的目的，有必要进行大剂量调整。已有例子证明这种差异的存在会影响治疗的效果。例如，某种药物主要有CYP450 2D6进行代谢，大约有7%的高加索人对这种药物没有代谢能力，但是这个比例在别的人种通常要低得多。类似的报道也可见于其它的代谢途径，主要是CYP450 2C19，N-乙酰转移酶。不仅如此，很多酶的代谢消除途径，包括绝大部分由CYP450代谢酶介导的，可以被联合用药中的其它药物抑制或诱导，结果，患者共服其它化合物会发生治疗情况的突然改变。这种药物相互作用会引起血液和组织中药物和代谢物浓度减少或增加，或者引起有毒物质的积蓄（如一些抗组胺药与抗真菌药间的相互作用）。这些变化能极大地改变一个新药的安全性和有效性，特别是有效治疗浓度范围比较窄的药物。
如果了解药物代谢途径和可能存在的药物相互作用，有时允许使用那种若血药浓度不能预测而会产生毒性浓度的药物。由于这些原因，所以在新药研究的早期弄清楚药物到底是通过原形排泄的还是通过一种或者多种途径进行代谢消除的是非常重要的。假如代谢消除是主要途径，那么需要了解其主要的代谢途径。这些信息将有助于认识个体之间代谢差异的意义和一些药物-药物、药物-其它物质相互作用的重要性。这些资料也有助于决定一些代谢物的药理活性是否需要进行进一步的研究。
此FDA工业指南提供了研究体外药物代谢和药物相互作用的一些建议。本指导原则鼓励只要可能和合适全面评估体外代谢和相互作用应作为常规工作，像其它所有FDA指导性文件一样，建议并非是需要的东西，但是，可供药物研究科学家们作为一种方法思考潜在的大量安全性的担忧。FDA认识到，任何方法的重要性都将视研发药物及其临床使用的不同而变化。FDA还认识到，临床观察也能阐明本文件中对体外研究敏感的相同问题。鉴于本指南所提供的信息资料宽度和常常可以减少或不必进一步的临床研究，因而提出的方法是有效和经济的。本指导原则适用于药物分子量在10000道尔顿（d）以下的分子。
尽管药物代谢和药物相互作用的体外评价研究足以用于制定本指导原则，但是还需要更多的工作以理解体外药物代谢（包括诱导和抑制）的特性及其对后续临床研究和产品标签的意义。由于体外药物代谢研究是一个快速发展的领域，因此，本指导原则也需要经常的修改。
一直以来，FDA的有关科学家就对药物代谢和相互作用对药物安全性和有效性的影响感兴趣。因此，这个问题的讨论也出现在FDA的其它指导文件里，包括General Considerations for the Clinical Evaluation of Drugs (FDA 77-3040)、Guideline for Studying Drugs Likely to be Used the Elderly (11/89)和Guideline for the Study and Evaluation of Gender Differences in the Clinical Evaluation of Drugs (58 FR 39406, 7月22日，1993)。
Ⅱ. 现象和结论
以下现象和结论是制定本指导原则的基础：
  循环在体内的原形药物和/或活性的代谢物浓度是决定药物产生疗效和/或负作用的原因；
  消除是体内调节药物浓度的主要方式，而代谢是药物消除的主要决定因素；
  即使那些本身不被代谢的药物，它们对其它同服药物代谢的潜在影响是重要的；
  由于代谢个体差异的存在，会引起不同个体之间的血药浓度产生很大的差异。一些药物如三环类抗抑郁药随着病人之间代谢酶的状况不同，血药浓度呈现数量级的差异。当一种药物抑制另一药物代谢时，药物相互作用同样有巨大的影响。例如，酮康唑极大地增加特非那定母体的血药浓度，导致消除时间延长和扭转峰值；
  最近应用人体组织和重组酶进行体外研究药物代谢和相互作用已取得较大进展；
  进行体外药物代谢和药物相互作用研究的关键因素是建立灵敏和专属的测定药物及其代谢物的特定测定方法，建立这些测定方法在药物研究中是优先考虑的因素，并且这些测定方法越来越多地用于研究的早期。一旦建立可靠的测定方法，这些测定技术就可以用于迅速评估体外药代谢和相互作用以及解释实验结果。
本指导原则所指的体外研究是指获得药物代谢和药物-药物相互作用知识的一套方法。机械论的和经验性临床研究方法也可以提供更多的信息与资料。通常，对实验方法进行合理细致地设计往往可以在最短的时间里以最少的费用得到最佳的实验结果。除了在药物研发过程的后期，要尽可能早地对药物代谢的影响和药物-药物相互作用进行研究。合理地设计药动力学/一期临床研究可以为药物代谢、相关的代谢物和实际的或者潜在的药物相互作用提供重要的信息。在二期和三期临床试验中得到的有关血药浓度的数据例如通过药动学筛选可以显示药物相互作用和个体差异的存在。由于在临床研究中有时限制使用其它药物，所以之后的一些研究无法最有效地提供可能的相互作用的资料。逐渐排除其它药物服用，测定服用试验药物前后的血药浓度（相互作用的筛选），以及对血药浓度测定次数的增加，可以使后期临床的研究更有效果。如果能鉴定重要代谢物和前体药物，并且发现它们的药理性质，那么所有此类研究就能提供更多的信息。
根据患者的遗传多态性或者其它易区分因素如年龄、种族、性别，区分其代谢差异可以有助于指导对这些人群更好地进行药物剂量设计的研究。这种资料也将运用于改进产品标签中的推荐剂量，通过事先进行剂量调整以促进药物安全有效的使用。的确，在一些情况下，如果懂得如何调节剂量以避免毒性反应的发生，那么就可允许具有毒性的药物进行销售。
Ⅲ. 药物代谢和药物相互作用的体外研究的技术和方法
进行药物体外代谢研究的目的有：（1）鉴定所有影响试验药物其及代谢产物的主要代谢途径，包括与代谢消除和形成中间体的具体代谢酶，和（2）探讨和预测试验药物对其它药物代谢的影响以及其它药物对试验药物代谢的影响。如果可行的话，应研究试验药物和其主要的代谢物的药理性质。若特殊药物不是某一代谢途径的底物，这种知识是有用的。例如，假如在药物研究早期已知一种药物分子并不是CYP450 3A4的底物或者这一途径对于整个药物代谢来说仅仅有很小的贡献，那么一些担忧就可以减少或消除，包括药物对3A4代谢可能的抑制作用（如酮康唑和红霉素）或药物（如利福平和抗惊厥药）对代谢可能的诱导作用。体外代谢研究也可以显示药物本身是否是一般代谢途径的抑制剂。当药物由相同的途径代谢时，一种药物有可能抑制其它药物的代谢，反之则没有可能，包括一种化合物主要的代谢途径。奎尼丁就是一个典型的例子，它不仅是CYP450 3A4的代谢底物，而且也是非常强的CYP450 2D6抑制剂。
A.  细胞色素P450，微粒体和有关方法
1.  试验药物的代谢评价
进行药物代谢体外研究（所涉及到的酶、形成的代谢物和可能的抑制剂）的最成熟的技术是包括CYP450超家族在内的一系列代谢酶系统。人类服用的大部分药物都是由这些代谢酶代谢的。代谢通常在肝脏进行，但是有些酶（特别是CYP450 3A4）在肠道代谢中也发挥重要作用。人肝微粒体为研究CYP450代谢提供了最合适的方法。微粒体是组织的一种亚细胞成分，通过差速高速离心获得。所有的CYP450代谢酶都集中在微粒体中。如果将微粒体或者整个肝脏在低温（如-70oC）下保存，则CYP450的活性可以保持许多年。由CYP450介导的代谢反应需要有辅助因子参与，主要是一个氧化还原支持系统如NADPH。对于大多数重要的药物代谢酶来说，可以在市场上购买到具有表型或没有表型的肝脏微粒体。
除非是对于特殊药物的研究，在鉴定一个新药的消除代谢途径过程中，应使用来自多个供体（单个或混合的）提供的微粒体，以避免一个或多个代谢途径有缺陷的微粒体。对每一种主要代谢途径，使用选择性的化学抑制剂可以容易地证明或排除新药的代谢途径。抑制剂和底物的孵育是保持方法选择性所非常必要的。例如奎尼丁和酮康唑在浓度低于1微摩尔时分别相对选择性抑制2D6和3A4，但是在较高浓度时，它们对其它的CYP450酶同样产生抑制，这种抑制作用是否有临床意义还不清楚。对于有些CYP450代谢酶的专属性，抗体也能用于阐明代谢途径的选择性抑制作用，但是与化学抑制剂比较由于缺乏大量可商业供应的抗体、它们的选择性表征不完全、抗体抑制剂实验结果在不同实验室之间的显示高度可变异性，而限制了这种方法的使用。
常用的CYP450的cDNA现在已经可以克隆，重组人酶蛋白已在各种细胞中表达，在使用微粒体测定明显的代谢途径后，这些重组酶用来确证由微粒体鉴定的结果是非常好的手段。
因为一个完整的肝脏体系具有充足的辅助因子并保持了与代谢酶有关的性质，所以一般都可以利用这个系统获得最完整的代谢谱。分离肝细胞或者精密肝切片也有上述性质。在这个阶段，放射性标记药物是有助于研究的。上述方法的主要问题是由于在酶活性在24小时以后就不稳定，所以克服酶活性不稳定性的限制对于研究酶活性诱导是有价值的。
体外研究能鉴定基本的代谢途径。对新药和由这些途径形成的代谢物研究的临床意义应通过临床研究来确证。通过体外代谢研究若没有发现某些重要途径可帮助排除进一步进行某些临床研究，或者至少有助于集中进行某些研究。
2.  对其它药物影响的评价
人类微粒体也是最有用的筛选一种新药常见CYP450代谢途径和提供潜在药物相互作用早期资料的工具。通常，通过共同孵育新药和标准探针化合物（许多CYP450的代谢途径就有标准探针）来评价新药对主要代谢途径的影响。这些实验特别快、简明、不需要特殊的设备。通常，若使用试验药物与确定好探针的合适浓度出现阴性结果（没有相互作用），那么一般就不必进行进一步的临床验证，而阳性结果则要求进行进一步的临床评价。
B.  其它肝药酶
虽然CYP450超家族酶是主要的代谢酶，但是人体内还存在其它种类重要的药物代谢酶，包括乙酰化、甲基化、葡萄糖醛酸、硫酸化和去酯化酶（酯酶）。这些酶的体外代谢研究虽然没有像CYP450那样广泛应用，但是已经取得了一些重要进展，更多的研究正在进行中。
除了CYP450酶，微粒体还包含其它的酶，包括各种转移酶。对于结合反应途径，加入底物与辅助因子可成功进行反应。虽然胞液（可溶性）酶不包括在微粒体中，但是可以用其它的亚细胞组分进行研究。
C.  胃肠道药物代谢
由于肝脏一直被认为是药物代谢的主要部位，所以许多重要的药物代谢研究都集中在这个器官。但是对于有些特殊的药物，其它组织（如肾脏或胃肠粘膜）可能是主要代谢部位。大多数药物是经口服给药，因此胃肠粘膜酶对进入系统循环药物的影响正引起人们的兴趣。对CYP450 3A4代谢敏感的药物呈现出低的或可变的生物利用度。因此，测定药物对CYP450 3A4代谢的敏感性不仅对鉴定消除途径，而且对预测显著的首过代谢均有重要意义。
D.  不同物种间的代谢比较和动物数据的使用
动物毒理学研究是评价人类用药安全性的重要方面。虽然很久以前人们就对比较代谢学产生了兴趣，但是近年来越来越得到重视。许多药物研发过程在动物实验中鉴定了大量的代谢物。虽然这些工作并不是与人的结果相平行，但这些手段的可用性为体外研究人体代谢提供了机会及集中和增加动物药动学和代谢研究的目的性。
动物研究提供了一种方法，用于测定由人代谢研究所产生的新的化学种类是否具有药理（毒理）活性，它们与母体化合物比较强度如何，母体化合物常常是产生药物-药物相互作用和遗传多样性的主要因素。通过体外研究早期鉴定人消除代谢途径和代谢物，那就可以为动物的实验前研究提供明确的方向。
应用体外研究和合适的临床随机研究比较药物与代谢物在人类和动物身上的差异。合理地相同给药支持特殊动物种评价潜在人体危险性的关联性。出现种属差异（如在动物体内发现毒性代谢产物，而在人类却没有）将有助于解释临床数据。越早完成这方面的研究就将越容易应用这些发现设计和解释临床研究数据。对非临床试验应用体外技术测定代谢最相关的种属和增加这些研究的价值，但是要选择一个合适的种属或菌株并非一件容易的事，特殊种属和菌株毒理学研究的历史对照数据与对以前经验的要求限制了根据与人代谢途径相似性选择种属和菌株的能力。
Ⅳ. 体外与体内研究的相关性
全面了解体外与体内代谢的关系仍然显得很重要。合理设计的体外与体内研究已报道有很好的相关性，但是在这些相关性被完全验证前，还要进行相当多的工作，包括对相关性存在的任何限制。如果体外与体内结果产生差异时，那么体内结果往往替代体外研究结果。然而，在很多情况下，由于体外代谢研究的廉价和易于进行，因此将为一种合适的筛选方法，可用于排除某种代谢途径的重要性，并且没有必要进行体内试验。假如体外代谢的研究表明对于问题“CYP450 2D6对这种药物有代谢作用吗？”的回答是“没有”的话，那么就没有必要进行慢代谢表型的影响的临床研究或进一步对CYP450 2D6抑制剂的影响研究。然而，由于体外研究不能合适定义代谢途径的重要性，假如对以上那个问题的回答为“是”的话，那么就需要进行进一步的临床研究以回答是否CYP450 2D6对药物的消除具临床上的重要性。另外需要进一步研究以确定哪些抑制剂（如果有的话）会对体内代谢产生显著影响。例如，一种药物虽然在体外可以被广泛代谢，但是体内质量平衡研究证明代谢重要性不如尿或胆排泄。另外，抑制作用往往不能被体外研究所确定，除非只有较低程度的抑制作用存在（中度或者高度抑制作用需要进行临床证明），在这种情况下代谢途径的抑制将没有临床影响，除非患者具有严重的排泄功能缺陷，对消除诱导的影响也是有限的。一般而言，如果有一些但不大的体外影响，那么预测体内的影响是困难的。另外体外研究实验的浓度要与体内有关浓度一致。如前所述对化学抑制剂研究不同的浓度将影响不同的代谢途径，但是如果相互作用发生在肠道，那将难以测定。
Ⅴ. 药物代谢研究的时间
一个经常提出的问题是在药物的研发中什么时候应该进行体外研究。在一个药物还没有确定是否具有临床活性之前，投资方是不愿意投资的。因此在着手进行主要的代谢研究之前，一个短期的临床研究阐明一些有用的活性是合理的。然而，如果早期了解一种化合物是怎样被代谢的就可以帮助从几个药理活性相似的化合物中加以选择和指导给药方式，使临床效果更加明显。当要决定进行体外代谢研究的最佳时机时，重新考虑进行这些研究的动机是有帮助的。如先前提到的，两个主要的临床原因是：（1）与药物及代谢物有关的所有的代谢途径的确定；（2）预测药物对其它药物代谢的影响。根据这些目的，在开始二期临床研究之前了解药物体外代谢的情况对后续研究是有用的，特别是对研究对象更加广泛的三期临床来说显得尤其重要。对应用上述知识可有效设计临床剂量/响应、药物相互作用的研究和对特殊人群研究，并且可以在二期和三期临床中对患者的变异性和药物相互作用引起足够的注意。当然，在药物研究后期才进行药物消除代谢途径评价或者根本没有进行过评估，药物也可以成功开发。然而，现在一个药物如果还不能提供它是怎样被代谢、它会怎样影响其它药物以及它被其它物质影响情况的资料，那么难于判断这个药物是否能销售。因此，鼓励投资者在三期临床研究开始之前进行适当的代谢研究。
Ⅵ. 标签
每年都有大量新的药物-药物相互作用被发现，处方者不可能记住所有的药物相互作用。根据越来越多的这方面有价值的信息，可以将各种酶的不同作用将正在不断增加的部分数据进行外推，然后将其进行标注。按药物种类规范标签，即标签标准化是当务之急液是有益的。例如一种强的代谢抑制剂（如奎尼丁对CYP450 2D6的抑制，酮康唑对CYP450 3A4的抑制）可能会影响与其有相同代谢途径代谢的其它药物的代谢。由于以上原因，假如一种新药已经被确定是CYP450酶的代谢底物，那么就可以预测某些可能存在的药物相互作用。即使缺少具体的实验数据，只要我们对药物及代谢产物的活性有了充分的认识，那么就有可能对实验结果进行准确的预测。同样地，它也可以帮助我们了解对于这种药物来说哪些代谢途径是不可能出现的。假如将体外研究的结果进行总结，那么需要明确指出进行预测总结的条件。因此，根据体外研究的结果预测临床的实际应用时，需要根据临床的体内研究的实际结果对预测结果进行验证和区分。在这些情况下，临床实验的结果才是最可靠的，然后将这种结果进行标签更新。下面这篇文章是根据体外研究情况进行标签内容的一个例子：
虽然还没有进行相关的临床研究，但是根据CYP450 3A4的代谢情况我们可以推断出酮康唑、伊曲康唑、红霉素和葡萄汁可能会对它的代谢产生抑制作用。此外，利福平、地塞米松和其它抗惊厥药（苯妥英、苯巴比妥、卡马西平）可以对药物的代谢产生诱导作用。因此，假如患者使用这种药物进行稳定剂量的滴注治疗，然后又开始使用以上的某种诱导剂或者抑制剂进行治疗的话，那么就需要对它的剂量进行调整以避免出现毒性反应或者治疗效果的失败。
下面这个例子说明了什么地方插入作用种类以及什么地方需要陈述有关药物抑制作用的资料：
这个药物由CYP450 3A4进行代谢，在治疗剂量下，药物本身不能对其它3A4的代谢作用产生抑制，但是它确实会对由CYP450 2D6参与的代谢产生抑制作用。
如果不能完全否定药物相互作用发生的可能性，在这种情况下，标签内容叙述阳性和阴性的资料可能是有助于医生和患者的。例如：
这个药物是CYP450 1A2的代谢底物。虽然环丙沙星是它的代谢抑制剂，但是奎尼丁、红霉素、酮康唑和伊曲康唑并不是它的抑制剂。
Ⅶ. 相关应用和注意点
用来评价药物-药物相互作用的相同方法也可以提供有关社会因素（吸烟、酒精）、环境因素（饮食如葡萄汁）和遗传因素对治疗效果影响的资料。例如，有几个研究已证明吸烟是一种CYP450 1A2酶的强诱导剂。因此，对于吸烟并接受茶碱治疗的患者推荐使用更大剂量的茶碱。将来，确证诱导以及抑制作用也可采用体外研究进行。特别是假如想要研发单个对映体，那体外临床前代谢研究应采用单个对映体而不是外消旋体进行。