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[转载]Western 杂交方法

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发表于 2005-10-18 18:34:38 | 显示全部楼层 |阅读模式
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作者:原版主 深山含笑

Western 杂交方法

3.1 Western所需试剂

3.1.1 Acr-Bis (29:1) 30% w/v

29g Acr, 1g Bis, 加入重蒸水定容至100ml,过滤,避光4℃保存。

3.1.2 分离胶buffer (4×)

1.5mol/L Tris-HCl (pH8.0)  0.4% (w/v) SDS

45.4g Tris, 10ml 10%SDS, 浓HCl约10ml, 调pH至8.8, 用重蒸水定容至250ml。 3.1.3 浓缩胶buffer (4×)

0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)  0.4% (w/v) SDS

15.15g Tris, 10ml 10%SDS, 浓HCl约10ml,调pH至6.8, 用重蒸水定容至250ml。

3.1.4 上样buffer (2×)

0.25mol/L Tris-HCl (pH6.8), 4% SDS, 20%甘油,痕量溴酚兰

50ml浓缩胶buffer (4×), 4g SDS, 20ml甘油,2mg溴酚兰,用重蒸水定容至100ml。

3.1.5 Tris-甘氨酸电泳buffer (10×) 1000ml

800ml重蒸水加热溶解2g SDS,加入30.2g Tris碱,144g甘氨酸,重蒸水定容至1000ml。

3.1.6 考马斯亮兰染液R250

225ml重蒸水溶解1.25g考马斯亮兰R250,225ml甲醇,50ml冰醋酸

3.1.7 转移buffer

750ml重蒸水溶解3.03g Tris, 14.4g 甘氨酸,200ml甲醇,加水定容至1000ml。

3.1.8 TBS (10×)

750ml 重蒸水溶解12.12g Tris, 88g NaCl, HCl 调节pH至8.0, 重蒸水定容至1000ml。

3.1.9 TBST (1×)

100ml TBS (10×), 0.5ml Tween-20 (0.05% v/v), 重蒸水定容至1000ml。

3.1.10 封闭液

0.3g BSA (3% w/v)溶于10ml TBST中。

3.1.11 AP缓冲液(10×)

   80ml重蒸水溶解0.59g NaCl, 0.102g MgCl2, 1.212g Tris-HCl, HCl调pH至9.5, 重蒸水定容至100ml。

3.1.12 NBT母液

   10ml 70%二甲基甲酰胺溶解0.5g NBT。

3.1.13 BCIP母液

   10ml 100%二甲基甲酰胺溶解0.5g BCIP。

3.1.14 丽春红染色液

   0.1g丽春红溶于5ml乙酸,加入重蒸水定容至100ml。

3.1.15 10% SDS-PAGE凝胶电泳分离胶的配制(10ml):

   4ml水,3.3ml 30%丙烯酰胺,2.5ml 1.5M Tris (pH8.8), 0.1ml 10% SDS, 0.1ml 10%过硫酸铵,4μl TEMED。

3.1.16 5% SDS-PAGE凝胶电泳浓缩胶的配制(5ml)

   3.4ml水,0.83ml 30%丙烯酰胺溶液,0.63ml 1M Tris(pH6.8), 50μl 10% SDS, 50μl 10%过硫酸铵溶液,5μl TEMED。  

3.2 Western操作程序

3.2.1 装好电泳系统,加入电极buffer, 上样。10/15 孔2mm样品最多上样36/28μl。

3.2.2 稳压200V,至溴酚兰刚刚跑出分离胶,约需1-1.5小时。

3.2.3 卸下胶板,染色,室温染1-2小时,沸水脱色。

3.2.4 剪与胶等大的NC膜,四张滤纸,将NC膜,滤纸和海绵浸入转移buffer中,至少5分钟。

3.2.5 按(-)黑板-海绵-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-红板(+)装好,除尽气泡。

3.2.6 4℃,100V转移1小时。

3.2.7 取出NC膜,浸入10ml封闭液中,37℃ 1-1.5小时。

3.2.8 倒出封闭液,4℃可保存2周。

3.2.9 按效价加入一抗于10ml TBST中,37℃ 1小时。倒出一抗,4℃可保存2周,20ml TBST清洗10分钟3次。

3.2.10加入二抗于10ml TBST中,37℃ 1小时,倒出二抗,4℃可存2周,20ml TBST洗10分钟3次。

3.2.11加入10ml AP buffer, 66μl NBT母液,33μlBCIP母液,混匀现色2-5分钟至条带出现,取出NC膜,置于20ml重蒸水中,终止反应并清洗2-3次。

3.2.12 晾干,保存于保鲜膜中。



4 线粒体提取

4.1 取 4g材料加入10ml线粒体提取缓冲液(0.4M 蔗糖,50mM MOPS-NaOH, 5mM EDTA, 0.2%BSA, 4mM Cys, pH7.7).

4.2 四层纱布过滤。

4.3 滤液在1500g离心10min。

4.4 取上清,在15000g离心20min。

4.5沉淀重悬于洗涤介质中(0.4M蔗糖,10mM MOPS-NaOH, 1mM EDTA, 0.2%BSA, pH7.2)。

4.6 1000g 离心10分钟。

4.7 转移上清到一个干净的离心管中,在其下层铺一个8ml的液体梯度,含10mM MOPS, pH7.2, 0.6M 蔗糖,1mM EDTA, 0.2%BSA。

4.8 9250g离心10分钟。

4.9 除去上清,沉淀溶于1-2ml的呼吸缓冲液中(0.25mM蔗糖,10mM MOPS,2mM MgCl2,2mM磷酸钾和0.2%BSA,pH7.2)。



5 考马斯亮兰法测定蛋白质含量

5.1 溶液的配制

5.1.1标准蛋白溶液的原液配制:10mg牛血清蛋白,溶于100ml蒸馏水中,配成100μg/ml原液。

5.1.2 考马斯亮兰G-250试剂的配制:100mg考马斯亮兰G-250溶于50ml 90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100ml,用蒸馏水定容至1000ml。



5.2 测定步骤

5.2.1 系列标准蛋白溶液的配制:

1# 2# 3# 4# 5# 6#

标准液(μl)  0  200  400  600  800  1000

蒸馏水(μl)  1000  800  600  400  200  0

蛋白含量(μg)  0  20  40  60  80  100



5.2.2 准确吸取各标准溶液及待测溶液200μl,加入考马斯亮兰G-250试剂1000μl,放置2分钟后,于595nm下比色,作出标准曲线,根据标准曲线计算样品的含量(单位:μg/μl)。
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